本发明专利技术公开了一种红桂木凝集素促进人外周血CD4+T淋巴细胞增殖活化并抑制人急性淋巴细胞白血病Jurkat?T细胞增殖和迁移的方法，从红桂木种子分离纯化红桂木凝集素整个过程中在1-5℃条件下进行，通过MTT实验、DNA分析和流式细胞术证实红桂木凝集素能促进外周血T淋巴细胞CD4亚群的增殖和活化，是一种比PHA更高效的CD4+T淋巴细胞丝裂原，为抗病毒感染及开发疫苗增强剂提供了新型有效的途径；通过CCK-8实验、DNA分析、细胞凋亡分析、ELISA实验、迁移实验等证实红桂木凝集素能明显抑制Jurkat?T淋巴细胞的增殖和迁移，是一种比PHA更高效的急性淋巴细胞白血病细胞的生长抑制剂，为血液系统恶性肿瘤的治疗提供了新的有效的辅助手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抑制人急性淋巴细胞白血病Jurkat T细胞增殖和迁移的凝集素，特别是红桂木凝集素促进人外周血CD4+T淋巴细胞增殖和活化并抑制人急性淋巴细胞白血病 Jurkat T细胞增殖和迁移的方法。
技术介绍
白血病是造血系统的恶性疾病，又称“血癌”，是国内十大高发恶性肿瘤之一。其特点是骨髓及其他造血组织中有大量白血病细胞无限制增生，并进入外周血液，而正常造血细胞的产生及其正常的生物学功能受到明显地抑制。该病居年轻人恶性疾病中的首位，特别是儿童成了白血病的高发人群。现在，白血病已经严重危害了人们的生命安全。因此，对于白血病的发生发展、诊断和防治研究显得尤其重要。从造血系统中血细胞的分化发育与成熟过程来看，血细胞按所属系列分六大系统，即红细胞系、粒细胞系、单核细胞系、淋巴细胞系、浆细胞系和巨核细胞系。每一系统又依细胞成熟水平分为原始、幼稚和成熟三个阶段；红系和粒系的幼稚阶段又分为早幼、中幼和晚幼三个阶段；而粗细胞根据胞浆所含颗粒特点的不同，又分为中性、嗜酸性和嗜碱性粒细胞。造血细胞的分化发育是一个异常复杂的过程，受到脑内外多种因素的调节作用。 例如，转录因子PU. 1和GATA-I是被广泛承认的在髓系细胞发育过程中起重要作用的调控因子，PU. 1表达上升会抑制GATA-I的表达，阻滞红系分化，促进髓系造血细胞的发育。在髓系细胞分化发育过程中，PU. 1主要调控一系列编码生长因子和粘附分子基因的表达。PU. 1 通过结合在造血发育相关的靶基因启动子上的PU. 1结合位点，来调节靶基因的转录，从而参与造血发育的调控。红桂木系亚热带、热带植物，广西桂东南地区盛产，其种子中含有丰富的凝集素。 植物凝集素是一类具高度特异的糖结合活性的蛋白。它们能与动物、植物、微生物细胞发生特异的作用，诱发一定的生理效应。自从Sumner第一次分离纯化到植物凝集素——伴刀豆球蛋白A以来，目前已有1000多种植物被报道含有凝集素。由于凝集素能选择性地识别细胞膜糖脂或糖蛋白糖链的不同糖基，在生化、医学上，植物凝集素常用于细胞的分型、分离、 糖蛋白和有丝分裂原的纯化、鉴定微生物、肿瘤诊断、治疗及预防和骨髓移植等；在免疫学上，植物凝集素能够促淋巴细胞的有丝分裂，是一种重要的丝裂原。其与淋巴细胞表面的相应受体结合，刺激静止淋巴细胞转化为淋巴母细胞和有丝分裂。随着基因工程的发展，植物凝集素已成为一种很有潜力对抗疾病的工具，可以用作定位因子与药物或载体结合使之具有靶向功能。例如癌细胞在发生、发展过程中，细胞表面糖链结构发生了变化而被某些凝集素识别，当该凝集素与药物藕联可赋予后者以导向杀伤能力，并可能有助于对病毒和肿瘤细胞产生免疫应答。经检索，红桂木凝集素促进人外周血CD4+T淋巴细胞增殖和活化，抑制人急性淋巴细胞白血病Jurkat T细胞增殖和迁移未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种红桂木凝集素促进人外周血CD4+T淋巴细胞增殖活化抑制人急性淋巴细胞白血病Jurkat T细胞增殖和迁移的方法。本专利技术是这样实施的红桂木凝集素促进CD4+T增殖抑制Jurkat T的方法，是从红桂木种子中分离纯化红桂木凝集素，利用红桂木凝集素对T淋巴细胞CD4亚群的增殖和活化，并抑制人急性淋巴细胞白血病Jurkat T细胞的增殖。所述的分离纯化红桂木凝集素，在常规分离方法的基础上，与现有技术不同的是本专利技术所有的操作均在1-5°C下进行。得到红桂木凝集素冻干粉经0. 01mol/L磷酸盐缓冲液溶解，0. 22 μ m过滤器除菌，并配制不同浓度的红桂木凝集素溶液。所述的不同浓度红桂木凝集素溶液是0. 36 μ g/ml、1. 8 μ g/ml、3. 6 μ g/ml、 18 μ g/ml、36 μ g/ml、360 μ g/ml。所述的利用红桂木凝集素对T淋巴细胞CD4亚群的增殖的方法是将生长良好的人外周血T淋巴细胞，调整细胞浓度为IX 106/mL，接种于96孔板，设不同浓度的红桂木凝集素组和空白组，每组设3个复孔。37°C，CO2培养箱中培养72h，于结束培养前4h每孔加入20μ1 MTT溶液，继续孵育4h，先于倒置显微镜下观察细胞形态及数目。再将培养板离心，1500rpm，10min，弃上清，每孔加100 μ 1三联溶解液，避光放置于37°C培养箱中过夜， 次日取出，微量振荡器均勻振荡lOmin，用酶标仪测量OD57tlnm，并计算增殖率。同时，将生长良好的人外周血T淋巴细胞，以1 X 106/mL细胞浓度接种于6孔板，设不同浓度的红桂木凝集素组和空白组，每组设3个复孔，37°C，C02培养箱中培养Mh，加入anti-CD3-PerCP、 anti-⑶4-FITC和anti-⑶8-PE荧光抗体，流式细胞术分析⑶4、⑶8细胞亚群比例。所述的利用红桂木凝集素对T淋巴细胞CD4亚群的活化的方法是将生长良好的T淋巴细胞，调整细胞浓度为lX106/ml，设不同浓度的红桂木凝集素组、PHA对照组和空白组，每组设3复孔，37 °C培养Mh，收集细胞，PBS洗涤，加入anti-CD3-PerCP和 anti-CD25-PE荧光抗体，避光孵育30min，PBS洗涤，加入300 μ IPBS重悬细胞，流式细胞术分析⑶25的表达情况。所述的对T淋巴细胞⑶4亚群的增殖和活化，其过程如下(1)人外周血淋巴细胞的分离培养按常规方法进行。(2)红桂木凝集素对人外周血T淋巴细胞生长的影响用常规MTT法进行。(3)红桂木凝集素对细胞周期的影响用常规PI染色及流式细胞术进行。(4)红桂木凝集素对CD4和CD8细胞亚群分布的影响用荧光抗体染色及常规流式细胞术进行。(5)红桂木凝集素对CD25表达的影响用荧光抗体染色及常规流式细胞术进行。所述的抑制人急性淋巴细胞白血病Jurkat T细胞的增殖和迁移的方法将生长良好的Jurkat T细胞，调整细胞浓度为1 X 106/mL,接种于96孔板，设不同浓度的红桂木凝集素组、PHA对照组和空白组，每组设3个复孔。370C，C02培养箱中培养72h，于结束培养前 4h每孔加入10 μ 1 CCK-8溶液，继续孵育池，用酶标仪测量0D570nm，并计算出增殖抑制率。5所述的抑制人急性淋巴细胞白血病Jurkat T细胞的迁移的的方法取生长良好的Jurkat T淋巴细胞，用不含血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为lX106/mL，接种100 μ 1细胞悬液于Transwell迁移小室内，另在M孔板中加入含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，将Transwell小室移入M孔板内，设不同浓度的红桂木凝集素组和空白组，每组设3复孔，37°C培养12h，取出小室，向M孔板内加入CCK-8溶液，检测Transwell迁移小室外的细胞数目情况，从而判断细胞的迁移率。所述的抑制人急性淋巴细胞白血病Jurkat T细胞的增殖和迁移，其步骤过程如下(1) Jurkat T淋巴细胞培养以常规方法进行。(2)红桂木凝集素对Jurkat T淋巴细胞增殖的影响用常规CCK-8法进行。(3)红桂木凝集素对CD25表达的影响用常规荧光抗体染色及流式细胞术进行。(4)红桂木凝集素对细胞因子IL-2和IFN- γ分泌的影响用常规ELISA法进行。(5)红桂木凝集本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种红桂木凝集素促进ＣＤ４＋Ｔ增殖活化并抑制Ｊｕｒｋａｔ Ｔ细胞的方法，是从红桂木种子中分离纯化红桂木凝集素，利用红桂木凝集素对Ｔ淋巴细胞ＣＤ４亚群的增殖和活化，并抑制人急性淋巴细胞白血病Ｊｕｒｋａｔ Ｔ细胞的增殖和迁移。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾麒燕，崔博，王婧娉，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：45
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