本发明专利技术公开了一种体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，包括以下步骤：1)制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC；2)表位肽负载aAPC；3)负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL；对所获得的抗原特异性CTL采用Tetramer染色法测定其数量：荧光素标记的链亲和素与4个生物素标记的MHC-肽复合物结合形成四聚体（Tetramer），得MHC-肽四聚体；MHC-肽四聚体与抗原特异性CTL上的TCR结合后，通过流式细胞仪进行检测。采用该方法可以用于扩增抗HBV的T淋巴细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物技术的细胞生物学和免疫学等领域，涉及以HBV细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)表位肽包被人工抗原提呈细胞(artificial antigen-presentingcells，aAPC)在体外诱导HBV特异性CTL，用于杀伤表达HBV抗原的细胞。
技术介绍
慢性乙型肝炎病毒感染的治疗仍然是医学界面临的重大难题，目前抗HBV治疗的药物还不能彻底清除病毒，如何有效清除HBV依然是乙型肝炎治疗研究的热点。(I)HBV特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)是机体清除 HBV的重要因素。研究多克隆、多特异性、强应答的特异性CTL的制备方法，对慢性乙型肝炎的治疗具有重要意义。已有研究表明，HBV特异性CTL是机体清除HBV的重要因素急性乙型肝炎患者清除HBV主要由⑶8+CTL介导，CTL可通过致肝细胞溶解和/或非溶解两条途径清除肝细胞内的HBV(尤其是HBV cccDNA)，发挥抗病毒效应。急性乙型肝炎患者体内的CTL常为多克隆、多特异性、强应答及高IFN-Y分泌的。相反慢性乙型肝炎患者的HBV持续感染与宿主T细胞免疫应答不足相关。研究发现，慢性乙型肝炎患者体内抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)的抗原提呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信息传递给机体的免疫系统，因此慢性乙型肝炎患者体内的特异性CTL常表现为寡特异性、弱应答。由此可见，过继输入足够量的多克隆、多特异性、强应答的特异性CTL来清除病毒，可与目前抗病毒治疗相互补充，解决不能彻底清除肝细胞内病毒的问题。(2) aAPC是用人工的方法模拟APC)的功能——T淋巴细胞活化信号，可在体外活化特异性T淋巴细胞。目前常用的方法是在磁珠表面交联抗CD^单克隆抗体(mAb)和MHC I-Ig 抗原肽复合物，该磁珠可以诱导活化抗原肽特异性的CTL。由于aAPC具有较高的可操控性，可人为控制MHC抗原肽复合物，从而实现对CD8+T淋巴细胞活化的调控，并有活化条件较均一，质量易控制，T细胞活化增殖周期短等优点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种体外诱导HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，采用该方法可以用于扩增抗HBV的T淋巴细胞。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性 T淋巴细胞的方法，其特征是包括以下步骤1)、制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC 采用MHC I-Ig和抗OT^mAb包被磁珠用直接包被法将MHC I-Ig和抗CD28 mAb 包被在磁珠上，构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC ；2)、表位肽负载aAPC MHC I-Ig和抗⑶观mAb包被的aAPC经PBS洗涤，以PBS将表位肽分别配制成浓度为20 40 μ g/ml多肽溶液，再将洗涤后的aAPC以4 8X 108/ml浓度重悬到所述多肽溶液中，得负载抗原肽的aAPC ；负载的表位肽的序列为以下任意一个 FLPSDFFPSV ；②ILCWGgLMTL;③QLLWFHISCL;④TLATWYGVNL;⑤YLVSFGVWIR;⑥SWLSLLVPFV;⑦FLLSLGIHLN;⑧FLLTRILTIP ；(9) ILSTLPETTV ；⑩NLEDPASRDL ；3)、负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL 分离HLA_A*0201正常人外周血PBMC细胞，以MACS技术分选获得⑶8+T细胞；将 ⑶8+T细胞与负载抗原肽的aAPC在培养基中37°C，5% C02培养刺激3 4周，所述培养基 % OpTmizer T-Cell Expansion SFM serum free, 2% heated inactivated humanserum, 100-200IU IL-2 ；再以磁铁吸附分离抗原特异性CTL ；对所获得的抗原特异性CTL采用Tetramer染色法测定其数量荧光素标记的链亲和素与4个生物素标记的MHC-肽复合物结合形成四聚体 (Tetramer)，得MHC-肽四聚体；MHC-肽四聚体与抗原特异性CTL上的TCR结合后，通过流式细胞仪进行检测。采用本专利技术的方法可以用于扩增抗HBV的T淋巴细胞。 具体实施例方式1)制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC 采用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法将MHC I-Ig和抗⑶观mAb 包被在磁珠(Dynabeads M-450，购自invitrogen)上，构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC ；具体方法灭菌的0. IM硼酸盐缓冲液洗涤磁珠两次，使磁珠与1 1混合的 HLA-A2-Ig和anti-CD28 mAb9. 3 (抗⑶沘的单克隆抗体，购买)在旋转器上4°C孵育Mh。 用洗磁珠缓冲液洗涤两次，再在含有洗磁珠缓冲液中孵育Mh，然后其去洗液，加入新鲜的缓冲液。制备的aAPC最后每个磁珠含有0. 9\105分子的!11^42-化和1. 9 X IO5 anti-OT^ mAb 9. 3分子。制备好的磁珠4°C可保存3个月。包被后的磁珠即为aAPC。2)、表位肽负载aAPC MHC I-Ig和抗⑶观mAb包被的aAPC经PBS洗涤，以PBS将表位肽分别配制成浓度为20 40 μ g/ml多肽溶液，再将洗涤后的aAPC以4 8X 108/ml浓度重悬到所述多肽溶液中，得负载抗原肽的aAPC ；负载的表位肽的序列可选用以下任意一条①FLPSDEFPSV，即PheLeu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val (SEQ ID NO :1)；②ILCWGgLMTL ；③QLLWFfll SCL ；④TLATWYGVNL ；⑤YLVSFGVWIR ；⑥SWLSLLVPFV ；⑦FLLSLGIHLN ；⑧FLLTRILTIP;⑨ILSTL￡ETTV ；⑩NLEDPASRDL。在本实施例中选用的是第①条。3)、负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL 分离HLA_A*0201正常人外周血PBMC细胞，以MACS技术分选获得⑶8+T细胞(德国milteny公司产品“CD8+T Cell Isolation Kit”，按试剂盒说明书操作)；将 ⑶8+T细胞与负载抗原肽的aAPC在培养基中37°C，5% C02培养刺激3 4周，所述培养基为 0pTmizer T-Cell Expansion SFM serum free (Gibco),2 % heated inactivated humanserum(Gibco)，100-200IU IL-2 ；再以磁铁(DynaMag-2，Dynabeads)吸附分离抗原特异性CTL(按使用说明书操作)。对所获得的抗原特异性CTL采用Tetramer染色法测定其数量荧光素标记的链亲和素(购买)与4个生物素标记的MHC-肽复合物(委托商业公司合成)结合形成四聚体(Tetramer)，得MHC-肽四聚体；MHC-肽四聚体与抗原特异性 CTL上的TCR结合后，通过流式细胞仪进行检测。抗原特异性CTL比例在10%以上，较对照组提高30%以上。最后，还需要注意的是，以上本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞的方法，其特征是包括以下步骤：１）、制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞ａＡＰＣ：采用ＭＨＣ Ｉ－Ｉｇ和抗ＣＤ２８ｍＡｂ包被磁珠：用直接包被法将ＭＨＣ Ｉ－Ｉｇ和抗ＣＤ２８ｍＡｂ包被在磁珠上，－肽四聚体与抗原特异性ＣＴＬ上的ＴＣＲ结合后，通过流式细胞仪进行检测。０－２００ＩＵ ＩＬ－２；再以磁铁吸附分离抗原特异性ＣＴＬ；对所获得的抗原特异性ＣＴＬ采用Ｔｅｔｒａｍｅｒ染色法测定其数量：荧光素标记的链亲和素与４个生物素标记的ＭＨＣ－肽复合物结合形成四聚体（Ｔｅｔｒａｍｅｒ），得ＭＨＣ－肽四聚体；ＭＨＣＴ细胞与负载抗原肽的ａＡＰＣ在培养基中３７℃，５％ＣＯ２培养刺激３～４周，所述培养基为ＯｐＴｍｉｚｅｒＴＭ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ，２％ｈｅａｔｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ，１０ＧＩＨＬＮ；⑧ＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰ；⑨ＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶ；⑩ＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬ；３）、负载抗原肽的ａＡＰＣ体外诱导ＨＢＶ抗原特异性ＣＴＬ：分离ＨＬＡ－Ａ＊０２０１正常人外周血ＰＢＭＣ细胞，以ＭＡＣＳ技术分选获得ＣＤ８＋Ｔ细胞；将ＣＤ８＋浓度重悬到所述多肽溶液中，得负载抗原肽的ａＡＰＣ；负载的表位肽的序列为以下任意一个：①ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ；②ＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬ；③ＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬ；④ＴＬＡＴＷＶＧＶＮＬ；⑤ＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲ；⑥ＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶ；⑦ＦＬＬＳＬ构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞ａＡＰＣ；２）、表位肽负载ａＡＰＣ：ＭＨＣ Ｉ－Ｉｇ和抗ＣＤ２８ｍＡｂ包被的ａＡＰＣ经ＰＢＳ洗涤，以ＰＢＳ将表位肽分别配制成浓度为２０～４０μｇ／ｍｌ多肽溶液，再将洗涤后的ａＡＰＣ以４～８×１０８／ｍｌ...
【技术特征摘要】
1.体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，其特征是包括以下步骤1)、制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC采用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法将MHC I-Ig和抗CD^mAb包被在磁珠上，构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC ；2)、表位肽负载aAPCMHC I-Ig和抗CD^mAb包被的aAPC经PBS洗涤，以PBS将表位肽分别配制成浓度为 20 40 μ g/ml多肽溶液，再将洗涤后的aAPC以4 8X 108/ml浓度重悬到所述多肽溶液中，得负载抗原肽的aAPC;负载的表位肽的序列为以下任意一个 ① FLPSDFFPSV ； (2) ILCffGELMTL ； ③ QLLffFHISCL ； @ TLATWYGVNL ； YLVSFGVWIR ； SWLSLLVPFV ；⑦FLLSLGIHLN ；⑧FLLTRIL...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱海红，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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