本发明专利技术公开一种鼠尾藻凝集素及制备方法，其特征在于是以鼠尾藻为原料，经冻干、粉碎、浸泡、离心、硫酸铵分级，DEAE-52离子交换层析和SephadexG-200凝胶过滤层析而得到，其分子量为17kD。所凝集的细胞广泛，对于兔、狗、羊、鲫鱼、鸡及人（A、B、AB）等红细胞均有凝集作用，其中对兔及鸡红细胞凝集反应的最低浓度分别为4.4mg/ml、0.55mg/ml，即使在100℃30min热处理后仍然对兔红细胞显示出血凝活性（活性下降75%）。糖抑制性实验表明，鼠尾藻凝集素仅被糖蛋白牛甲状腺球蛋白和γ-球蛋白所抑制，最小抑制浓度分别为1.25mg.mL-1和2.5mg.mL-1。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种凝集素及制备方法，尤其是ー种凝集细胞广泛的。
技术介绍
凝集素(Lectin)是非免疫起源的具有糖专ー性、可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白。凝集素在自然界中分布极广，从病毒到人类，几乎所有的物种中，均已分离得到了凝集素，其中最初发现的是植物凝集素。1966年，Boyd等人在一些热带海藻中发现了海藻凝集素的存在，此后Blunden和Rogers等对英国沿海的海藻检测了提取物的凝集活性，但是发现只有很少的ー些海藻提取物对未经处理的人血红细胞有一定的凝集作用，之后Hori等 又对越南海藻凝集素进行了筛选。Hori报道至1994年，人们从10种绿藻、13种红藻中分离纯化出凝集素，并且从其中5种红藻中得到了部分纯化制品。之后，人们又对隅江蓠iGracilaria cor/ ea)、绒线藻(Zfe1Sja villosa )等进行了分离纯化及其性质的研究,发现所提取的凝集素具有凝集细胞、參与原生质体形成、抑制肿瘤细胞增殖、激活淋巴细胞、抑制血小板凝集等多种功能的生物活性。褐藻虽然也是ー种海藻，但是由于常规提取物中含有多酚，故人们一直偏见地认为褐藻提取物凝集细胞现象只是多酚凝集血细胞的ー种假凝集现象，以至于迄今为止，对海藻凝集素的研究主要集中在红藻、緑藻，而关于褐藻门圆子纲马尾藻属鼠尾藻thunbergiiグ治// tee)凝集素的分离纯化未见报道。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术所存在的上述技术偏见，提供ー种凝集细胞广泛的。本专利技术的技术解决方案是一种鼠尾藻凝集素，其特征在于是以鼠尾藻为原料，经冻干、粉碎、浸泡、离心、硫酸铵分级，DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析而得到，其分子量为17kD。上述的鼠尾藻凝集素的制备方法，其特征在于按如下步骤进行 a.以新鲜鼠尾藻为原料，冻干、粉碎成粗粉，按质量体积(g/ml)比为I:1(Γ20向鼠尾藻粗粉中添加含O. 15mol.じ1NaCl的PBS缓冲液，4°C 30°C浸泡16 24h，5000r/min离心30min,取上清液； b.在冰水浴及搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至上清液中，使上清液中硫酸铵饱和度达65 85%,搅拌混勻后,5000r/min离心30min,收集沉淀,弃去上清； c.用生理盐水溶解沉淀并用生理盐水透析至无S042_后，采用I.6X 20cm DEAE-52纤维素离子交换层析柱，用梯度混合仪进行线性梯度洗脱，所述梯度混合仪混合瓶中的洗脱液I是PH 7.5的O. Olmol.じ1Tris-HCl缓冲液，所述梯度混合仪储藏瓶的梯度洗脱液II是pH 7. 5 含有 O. 8mol.じ1 NaCl 的 O. 15mol.じ1 Tris-HCl 缓冲液，洗脱流速为 3ml/10min，按每管3ml分管，收集23 31管的洗脱产物并浓缩；d.将上述浓缩的洗脱产物，上I. 6 X 90cm Sephadex G-200凝胶过滤层析柱，洗脱液为PH7. 2的O. 015mol/LPBS缓冲液，流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第51 59管的洗脱产物，冷冻干燥。本专利技术首次以鼠尾藻为原料，分离、纯化出凝集细胞活性强的鼠尾藻凝集素，所凝集的细胞广泛，对于兔、狗、羊、鲫鱼、鸡及人(A、B、AB)等红细胞均有凝集作用，其中对兔及鸡红细胞凝集反应的最低浓度分别为4. 4mg/ml、0. 55 mg/ml,即使在100°C 30min热处理后仍然对兔红细胞显示出血凝活性(活性下降75%)，而在25°C 50°C保温30min，活性均未见改变。糖抑制性实验表明，鼠尾藻凝集素仅被糖蛋白牛甲状腺球蛋白和Y-球蛋白所抑制，最小抑制浓度分别为I. 25mg. mじ1和2. 5mg. mじ1。本专利技术的鼠尾藻凝集素在pH6. 5 7范围内活性最闻。附图说明图I是本专利技术实施例经凝胶过滤所测分子量谱图。图2是本专利技术实施例DEAE-52纤维素离子交换层析的谱图。图3是本专利技术实施例Sephadex G-200凝胶过滤层析谱图。具体实施例方式a.鼠尾藻采回后立即用过滤海水洗浄，用纱布或滤纸吸干水分，放入-20°c冰箱中冷冻，然后置于冷冻干燥机中冻干，研磨成粉末，按质量体积(g/ml)比为I :20向鼠尾藻粗粉中添加含O. 15mol.じ1NaCl的PBS缓冲液，4°C浸泡16h，5000r/min离心30min，取上清液； b.在冰水浴及搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至上清液中，使上清液中硫酸铵饱和度达85%,搅拌混勻后,5000r/min离心30min,收集沉淀,弃去上清； c.用生理盐水溶解沉淀并用生理盐水透析至无S042_后，采用I.6X 20cm的DEAE-52纤维素离子交换层析柱，用PH值7. 5，0. Olmol/じ1 Tris-HCl缓冲液平衡至A28(l〈0. 01再上样，用梯度混合仪进行线性梯度洗脱，所述梯度混合仪混合瓶中的洗脱液I是PH 7.5的O. Olmol.じ1Tris-HCl缓冲液，所述梯度混合仪储藏瓶的梯度洗脱液II是pH 7.5含有O. 8mol.じ1 NaCl的O. 15mol.じ1 Tris-HCl缓冲液，梯度混合瓶与恒流泵相连，恒流泵与层析柱顶端相连，调好流速为3ml/10min，按每管3ml分管，收集23 31管的洗脱产物并浓缩； DEAE-52纤维素离子交换层析的谱图如图2所示经线性离子梯度洗脱，可得两个蛋白吸收峰，经紫外分光光度计检测在280nm时的吸光值后，对各蛋白质吸收峰进行凝集活性測定，用兔血红细胞进行检测，表明第一个蛋白峰(相对于23 31管)有凝血活性。d.将上述浓缩的洗脱产物，上I. 6X90cm Sephadex G-200凝胶过滤层析柱，洗脱液为 ρΗ7· 2 的 O. 015mol/LPBS 缓冲液(O. 015mol/L, Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7. 2)，流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第5广59管的洗脱产物，冷冻干燥得白色样品，即鼠尾藻凝集素。Sephadex G-200凝胶过滤层析谱图如图3所示可以分出两个吸收峰,经紫外分光光度计检测在280nm时的吸光值后，对各蛋白质吸收峰进行凝集活性測定，用兔血红细胞进行检测，表明第二个蛋白峰(相对于59管)有凝血活性。将所得产物经凝胶过滤分析其分子量为17kD，其谱图如图I所示，图中I是牛甲状腺球蛋白(MW669000D)，2是胰蛋白酶(MW23300D)，3是细胞色素C (Cytochrome C)(MWl2200D)，4是本专利技术实施例的鼠尾藻凝集素。实验及结果 凝集活性的測定方法 在96孔V型血凝板上用40 μ I本专利技术实施例凝集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀释后，加入2%红细胞悬液40 μ 1，振匀，室温放置2h后，肉眼观察，无凝集现象时红细胞沉积在V型孔底部呈大红点状，有凝集现象时呈网状不下沉，血凝活力以产生凝集现象时的最小凝集素量或凝集素最大稀释倍数表示。本专利技术实施例的鼠尾藻凝集素对10种红细胞有凝集作用，其中对鸡血细胞的凝集活力却高达27，实验结果见表I : 表I鼠尾藻凝集素血凝活性.....1 ! -!..................................本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种鼠尾藻凝集素，其特征在于是以鼠尾藻为原料，经冻干、粉碎、浸泡、离心、硫酸铵分级，DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析而得到，其分子量为17kD。2.根据权利要求I所述的鼠尾藻凝集素的制备方法，其特征在于按如下步骤进行 a.以新鲜鼠尾藻为原料，冻干、粉碎成粗粉，按质量体积(g/ml)比为I:1(Γ20向鼠尾藻粗粉中添加含O. 15mol.じ1NaCl的PBS缓冲液，4°C 30°C浸泡16 24h，5000r/min离心30min,取上清液； b.在冰水浴及搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至上清液中，使上清液中硫酸铵饱和度达65 85%,搅拌混勻后,5000r/min离心30min,收集沉淀,弃去上清； c.用生理盐水溶解沉淀并用生理...
【专利技术属性】
技术研发人员：李丹彤，周晓茹，
申请(专利权)人：大连海洋大学，李丹彤，
类型：发明
国别省市：
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