一种NT-proBNP荧光免疫试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种NT-proBNP荧光免疫试剂及其制备方法，属于医学检验测定技术领域。所述NT-proBNP荧光免疫试剂包括标记用NT-proBNP1抗体、标记用羊抗鸡IgY抗体、包被用NT-proBNP2抗体、包被用鸡IgY抗体、粒子重悬液、样品垫处理液，粒子重悬液：含100-200mM Tris的Tris-HCl重悬液(含250-500μg/ml鼠IgG，1-5％小牛血清，0.1-0.5％Pluronic F68，0.5-1％酪蛋白，0.9％NaCl，0.05％NaN3)，pH8-9；样品垫处理液：10mM PBS(含0.1mg/ml-0.5mg/ml植物凝集素)，pH7-8。并具体公开了NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法，包括特定的粒子标记、样品垫预处理、抗体在NC膜上的包被、以及试纸组装。本发明专利技术的NT-proBNP荧光免疫试剂灵敏度较高、应用范围广泛，可降低血清实验中的干扰，对红细胞具有更好的拦截效果。

【技术实现步骤摘要】
一种NT-proBNP荧光免疫试剂及其制备方法
本专利技术涉及一种NT-proBNP荧光免疫试剂及其制备方法，属于医学检验测定
本专利文件中所涉及之术语含义：0.9％NaCl：表示配置完成后的溶液中每100ml含NaCl0.9g。类似格式均表示类似含义，本文另有说明的除外。
技术介绍
心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段，具有较高的死亡率，相当于一些恶性肿瘤，研究显示心力衰竭的死亡率为43％，5年死亡率达90％，重度心力衰竭的死亡率更高。脑利钠肽(BNP)由于心室受到牵拉刺激或者张力升高而分泌，能够早期反映整体甚至局部心脏结构改变导致的功能变化。BNP来自心室肌细胞，最初合成的为前脑利钠肽原(pre-proBNP)，是由134个氨基酸组成的多肽链。pre-proBNP在心肌细胞中裂解为脑利钠肽原(proBNP，108个氨基酸)和信号肽(26个氨基酸)。proBNP进入血液后裂解为具有生理活性的BNP和氨基端-脑利钠肽原(NT-proBNP)，理论上两者是1∶1的关系。相对于BNP，NT-proBNP具有更长的血浆半衰期(60-120分钟)，BNP的血浆半衰期只有20分钟。NT-proBNP在血液中的分泌和存在具有累积作用，实际存在比BNP的浓度更高，更容易被检测到，即检测的敏感性提高，NT-proBNP更容易反映早期或者轻微心脏功能的变化。NT-proBNP具有更低的个体差异，不受个体生理性节律的影响。体外存放稳定性好，室温下可达3天，对标本运送、保存等非常重要。NT-proBNP与临床心衰的严重程度成比例，心衰越严重，NT-proBNP就越高；而且NT-proBNP能够区分轻度心衰和心功能正常者。鉴于NT-proBNP优于BNP对心力衰竭的诊断特点，2000年左右，国际上已经认定是NT-proBNP测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。目前国内外已有商品化的NT-proBNP试剂盒，如美国罗氏生产的NT-proBNP免疫检测试剂盒通过了美国FDA得认证，用于对充血性心衰的辅助诊断，使用了电化学发光的方法，灵敏度和精密度，准确度都很好，但是试剂价格昂贵。国外另有一些公司生产的NT-proBNP试剂盒利用酶联免疫技术开发。国内一些公司的N端脑钠肽原检测试剂采用了胶体金的技术等，存在诸多缺点，如酶联免疫试剂不稳定，血清实验中的干扰严重，样品垫对红细胞的拦截效果差，分辨率低，胶体金为定性检测或半定量检测等等。随着医学诊断技术向微量，高灵敏度，高特异性方向发展，酶联免疫，胶体金等技术已经出现不适应倾向。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种可降低血清实验中的干扰，使样品垫对红细胞的拦截效果好的NT-proBNP荧光免疫试剂。本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种NT-proBNP荧光免疫试剂，所述NT-proBNP荧光免疫试剂包括标记用NT-proBNP1抗体、标记用羊抗鸡IgY抗体、包被用NT-proBNP2抗体、包被用鸡IgY抗体、粒子重悬液、样品垫处理液，其中各组分：标记用NT-proBNP1抗体：100-300μg/1mg荧光粒子；标记用羊抗鸡IgY抗体：100-300μg/1mg荧光粒子；NC膜上划线的包被用NT-proBNP2抗体：2-3mg/ml，划线量：1μl/cm；NC膜上划线的包被用鸡IgY抗体：2-3mg/ml，划线量：1μl/cm；粒子重悬液：含100-200mMTris的Tris-HCl重悬液，pH8-9；样品垫处理液：10mMPBS，pH7-8。在上述NT-proBNP荧光免疫试剂中，所述的Tris-HCl重悬液还含250-500μg/ml鼠IgG，1-5％小牛血清，0.1-0.5％PluronicF68，0.5-1％酪蛋白，0.9％NaCl，0.05％NaN3。作为优选，所述的鼠IgG、小牛血清在加入粒子重悬液前均先在55-60℃下处理10min。在上述NT-proBNP荧光免疫试剂中，所述的PBS还含0.1mg/ml-0.5mg/ml植物凝集素。一种上述的NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法，所述的制备方法包括粒子标记、样品垫预处理、抗体在NC膜上的包被、以及试纸组装，其中，粒子标记为在粒子中同时加入EDC、NHS、BSA，以及NT-proBNP1抗体或羊抗鸡IgY抗体，在45-55℃下交联反应2h；交联后先清洗、乙醇胺封闭，然后用粒子重悬液重悬分别得NT-proBNP1抗体标记的荧光粒子或羊抗鸡IgY抗体标记的荧光粒子，最后将NT-proBNP1抗体标记的荧光粒子和羊抗鸡IgY抗体标记的荧光粒子混合得到粒子浓度分别为0.1-0.5mg/ml和0.001-0.01mg/ml的粒子混合液。本专利技术NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法生产方便，在粒子标记时可以同时加入EDC、NHS、BSA，以及NT-proBNP1抗体或羊抗鸡IgY抗体。与现有技术中37℃左右交联相比，本专利技术在45-55℃下交联反应标记的粒子更加稳定，受血清干扰物质干扰相对较少。在上述NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法中，在粒子标记中，交联反应前NT-proBNP1抗体、羊抗鸡IgY抗体均分别在45-55℃水浴中孵育24-48小时。通过不断试验发现，将NT-proBNP1抗体、羊抗鸡IgY抗体在交联反应前先进过上述处理后抗体相对稳定，检测结果也会相对稳定，血清相关性也会有所提高。在上述NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法中，在粒子标记中，加入少量BSA可以降低试剂本底。进一步的，粒子标记的具体步骤为：在1mg粒子中同时加入0.5mg-1mgEDC、0.5mg-1mgNHS，10-20μgBSA，以及100-300μgNT-proBNP1抗体或100-300μg羊抗鸡IgY抗体，在45-55℃下交联反应2h；交联后先用10mMPBSpH7.4清洗，再用40mM乙醇胺37度封闭1小时，接着用粒子重悬液重悬分别得NT-proBNP1抗体标记的荧光粒子和羊抗鸡IgY抗体标记的荧光粒子；将NT-proBNP1抗体标记的荧光粒子和羊抗鸡IgY抗体标记的荧光粒子混合在一起，得到粒子浓度分别为0.1-0.5mg/ml和0.001-0.01mg/ml的粒子混合液。与现有技术相比，本专利技术NT-proBNP荧光免疫试剂的组分配方合理有效，通过将荧光粒子分别与NT-proBNP1抗体、羊抗鸡IgY抗体进行稳定简单有效率的交联，再将交联后的两种荧光粒子用特定的粒子重悬液重悬处理混合，同时采用含植物凝集素的样品垫处理液处理样品，使制得的NT-proBNP荧光免疫试剂灵敏度较高、应用范围广泛，可降低血清实验中的干扰，对红细胞具有更好的拦截效果。附图说明图1为本专利技术试纸的结构示意图。图2为本专利技术实施例6中试剂的实际检测浓度平均值与理论浓度的线性回归分析图。图3为本专利技术实施例6中的试剂与对比例1中的试剂比对临床血清样品的相关性分析图。图4为对比例1中的试剂与对比例2中的试剂比对临床血清样品的相关性分析图。图5为本专利技术实施例6中的试剂与对比例3中的试剂比对临床全血样品的滤血效果图(箭头所指为样品垫和NC膜交界处)。附图标记列表：1、PVC胶板；2、样品垫；3、醋酸纤维本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NT‑proBNP荧光免疫试剂，其特征在于，所述NT‑proBNP荧光免疫试剂包括标记用NT‑proBNP1抗体、标记用羊抗鸡IgY抗体、包被用NT‑proBNP2抗体、包被用鸡IgY抗体、粒子重悬液、样品垫处理液，其中粒子重悬液：含100‑200mM Tris的Tris‑HCl重悬液，pH 8‑9；样品垫处理液：10mM PBS，pH 7‑8。

【技术特征摘要】
1.一种NT-proBNP荧光免疫试剂，其特征在于，所述NT-proBNP荧光免疫试剂包括标记用NT-proBNP1抗体、标记用羊抗鸡IgY抗体、包被用NT-proBNP2抗体、包被用鸡IgY抗体、粒子重悬液、样品垫处理液，其中粒子重悬液：含100-200mMTris的Tris-HCl重悬液，pH8-9；样品垫处理液：10mMPBS，pH7-8；所述的NT-proBNP荧光免疫试剂的制备方法包括粒子标记、样品垫预处理、抗体在NC膜上的包被、以及试纸组装，其中，粒子标记为在粒子中同时加入EDC、NHS、BSA，以及NT-proBNP1抗体或羊抗鸡IgY抗体，在45-55℃下交联反应2h；交联后先清洗、乙醇胺封闭，然后用粒子重悬液重悬分别得NT-proBNP1抗体标记的荧光粒子和羊抗鸡IgY抗体标记的荧光粒子，最后将NT-proBNP1抗体标记的荧光粒子和羊抗鸡IgY抗体标记的荧光粒子混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋海，张闻，周海滨，王建飞，
申请(专利权)人：宁波瑞源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33