西兰苔凝集素的制备方法与应用技术

本发明专利技术提供西兰苔凝集素的制备方法与应用，首先采用磷酸缓冲液浸提，硫酸铵沉淀，离心透析，再使用离子交换色谱SephadexA-52和凝胶色谱葡聚糖凝胶SephadexG-75柱分离纯化，得到纯化的西兰苔凝集素BL。本发明专利技术得到的西兰苔凝集素具有抗菌活性和抗肿瘤活性。癌细胞相比，西兰台凝集素对正常细胞的毒性小。因而，本发明专利技术得到的西兰苔凝集素有利于功能食品、医药和其它领域的开发利用。

【技术实现步骤摘要】
西兰苔凝集素的制备方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及西兰苔凝集素的制备方法与应用。
技术介绍
西兰苔，又称小小西兰花、芦笋型青花菜、青花笋，属十字花科芸薹属，由两种甘蓝类蔬菜西兰花与芥蓝杂交选育而成，因主要以肥嫩的花苔供食而得名。西兰花与芥蓝是蔬菜中公认的“抗癌”能手，而西兰苔集中了两者的优良性状，因此抗癌物质含量极高，同时还含有丰富的维生素A、B、E。据美国权威机构检测，其抗癌物质含量比普通蔬菜高出五到十倍，其抗肿瘤物质种类也多。凝集素(Lectin)是指一种糖蛋白或结合糖的蛋白，广泛存在于各种植物、无脊椎动物和高等动物中。大多数凝集素存在于植物的成熟种子中，但在叶、茎和根等组织器官中也有发现，它最大的特点是能够识别糖蛋白和糖脂，特别是细胞膜中复杂的糖链结构。凝集素对糖基的结合具有特异性，这可通过糖抑制试验进行研究，此特异性取决于凝集素中糖基结合位点的大小、形状、糖链中决定簇的位置等。凝集素具有细胞凝集能力，不仅能凝集红细胞，还能凝集肿瘤细胞，淋巴细胞，精子，细菌等。此外，凝集素还能识别并结合细菌、肿瘤细胞表面的糖结构，从而抑制它们的生长。鉴于凝集素的诸多功能，它被广泛应用于病原菌的防治，癌症的治疗，细胞的分型，含糖基生物大分子的检测等方面。近年来，国内外对凝集素的研究很多，越来越多的凝集素被发现，凝集素的生物学功能备受关注。但是西兰苔是一种新型蔬菜，目前国内外对西兰苔凝集素的分离纯化与应用尚未有报道。
技术实现思路
为拓展西兰苔在食品和生物医学领域的应用，大幅提高这种新型蔬菜的附加值，本专利技术的目的是提供西兰苔凝集素的制备方法与应用。为实现本专利技术目的，采用如下技术方案:(I)将西兰苔粉碎 后加入缓冲溶液调节pH值，低温保存，过滤，取滤液离心后取上清液，盐析，低温保存后离心去沉淀，将沉淀溶解透析冷冻干燥得到西兰苔凝集素粗品；(2)取步骤(1)所得西兰苔凝集素粗品溶解于缓冲液，离子交换层析，并梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素样品；(3)取步骤(2)得到的西兰苔凝集素样品溶解于缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G_75分离纯化，梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素。西兰苔凝集素的制备方法，具体步骤如下:(I)将西兰苔洗净，切碎，冻干后粉粹，得到干粉，准确称取干粉10~100g，加入100~500ml缓冲液，置于冰箱中，过滤，滤液离心后收集上清液，将上清液在搅拌条件下加入硫酸铵晶体至饱和度为10%~90%，冰箱中过夜，离心取沉淀，将沉淀加入蒸馏水溶解后，置于透析袋中进行透析，24h之后冷冻干燥，即为西兰苔凝集素粗品；(2)称取步骤(1)得到的西兰苔凝集素粗品50~300mg，溶解于0.5~5ml，pH为6~9的Tris-HCl缓冲液，用DEAE Sephadex A-52离子交换层析，并用NaCl溶液梯度洗脱，调节流速为0.5ml/min，每管收集8min，收集具有凝血活性的第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素样品；(3)称取步骤(2)得到的西兰苔凝集素样品10~200mg溶于0.5~5ml pH为6~9的Tris-HCl缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G_75分离纯化,再用NaCl溶液梯度洗脱，调节流速为0.5ml/min,每管收集8min,收集具有凝血活性的第一个蛋白峰冻干保存，得到纯化的西兰苔凝集素BL ；。上述方法中，步骤(1)中所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH=6~9 ;所述离心的离心温度为4~8°C，转速为3000 ~10000r/min，离心时间10~60min。上述方法中，步骤(2)中所述梯度洗脱为用浓度为0.lmol/L~lmol/L的NaCl溶液，洗脱5次；所述NaCl溶液的溶剂为Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液pH6~9。上述方法中，步骤(3)所述梯度洗脱为用浓度为lmol/L~3mol/L的NaCl溶液，洗脱5次；所述溶液溶剂为Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液pH6~9。上述方法中，所述西兰苔凝集素BL具有抗菌活性和抗肿瘤活性。西兰苔凝集素应用于抗菌功能食品或抗肿瘤医药的制备。与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果和优点:本专利技术得到的西兰苔凝集素BL分子量约为27KDa，糖含量为7.6%，最小凝血浓度为4μg/ml，具有D-甘露糖和阿拉伯糖结合位点。更重要的是，BL具有下述抗菌活性和抗肿瘤活性:(I)对各种细菌的50%抑制浓度(IC5tl)分别为:绿脓杆菌173.58μ g/ml，痢疾杆菌158.32 μ g/ml,金黄色葡萄球菌486.33 μ g/ml,大肠杆菌228.77 μ g/ml，幽门螺杆菌143.95 μ g/ml0对各种癌细胞和正常肝细胞的50%抑制浓度(IC5tl)分别为:胃癌细胞SGC-7901215.85 μ g/ml，乳腺癌细胞 MCF-7350.93 μ g/ml，肝癌细胞 H印G2178.82 μ g/ml，正常肝细胞L02924.35 μ g/ml.说明与癌细胞相比，西兰台凝集素对正常细胞的毒性小。因而本专利技术得到的西兰苔凝集素有利于功能食品、医药和其它领域的开发利用。附图表说明图1为实施例1中西兰苔凝集素(活性组分LI)离子交换色谱DEAE-52柱层析洗脱曲线；图2为实施例1中西兰苔凝集素BL凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadexG-75柱层析洗脱曲线；图3为实施例1所制备的西兰苔凝集素BL的SDS-PAGE图。图4为实施例1所制备的西兰苔凝集素BL的抗菌活性图。图5为实施例1所制备的西兰苔凝集素BL的抗癌活性图。【具体实施方式】以下结合附图和实例对本专利技术的具体实施作进一步说明，但本专利技术的实施和保护范围不限于此。实施例1西兰苔凝集素的制备方法，步骤如下:( I)将新鲜的西兰苔洗净，切碎，冻干后粉粹，得到干粉，准确称取干粉60g，加入300ml pH为6的磷酸缓冲液，置于4°C冰箱中24h，用三层纱布过滤，滤液离心后收集上清液，将上清液置于磁力搅拌器上，缓慢加入硫酸铵晶体至饱和度为70%，4°C冰箱中过夜，离心弃上清，将沉淀加入适量的蒸馏水进行溶解，置于透析袋中进行透析，24h之后冷冻干燥，即为凝集素粗品。(2)称取步骤(1)得到的凝集素粗品200mg，加2ml pH为6的Tris-HCl缓冲液溶解，用DEAE Sephadex A-52离子交换层析，并用NaCl溶液梯度洗脱，即用浓度为0.6mol/L的NaCl溶液洗脱5次；所述NaCl溶液的溶剂为pH=7Tris-HCl缓冲液，调节流速为0.5ml/min，每管收集8min，经洗脱分离收集，得到3个不同的组分，分离效果如图1所示。凝血试验表明，组分I (LI)具有较高凝集活性，收集具有凝血活性的第一个蛋白峰LI冻干保存。(3)称取步骤(2)得到的凝集素样品IOOmg溶于2.5ml pH为6的Tris-HCl缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadex G-75分离纯化。再用NaCl溶液梯度洗脱，SP用浓度为1.5mol/L的NaCl溶液洗脱5次；所述NaCl溶液的溶剂为pH=6的Tris-HCl缓冲液，调节流速为0.5ml/min,每管收集8min,Ll经Seph本文档来自技高网...

【技术保护点】
西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：（1）将西兰苔粉碎后加入缓冲溶液调节pH值，低温保存，过滤，取滤液离心后取上清液，盐析，低温保存后离心去沉淀，将沉淀溶解透析冷冻干燥得到西兰苔凝集素粗品；（2）取步骤（1）所得西兰苔凝集素粗品溶解于缓冲液，离子交换层析，并梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素样品；（3）取步骤（2）得到的西兰苔凝集素样品溶解于缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G‑75分离纯化，梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素。

【技术特征摘要】
1.西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，所述制备方法为: (1)将西兰苔粉碎后加入缓冲溶液调节PH值，低温保存，过滤，取滤液离心后取上清液，盐析，低温保存后离心去沉淀，将沉淀溶解透析冷冻干燥得到西兰苔凝集素粗品； (2)取步骤(1)所得西兰苔凝集素粗品溶解于缓冲液，离子交换层析，并梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素样品； (3)取步骤(2)得到的西兰苔凝集素样品溶解于缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-75分离纯化，梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素。2.根据权利要求1所述西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，具体步骤如下 (1)将西兰苔洗净，切碎，冻干后粉粹，得到干粉，准确称取干粉10~100g，加入100-500ml缓冲液，置于冰箱中，过滤，滤液离心后收集上清液，将上清液在搅拌条件下加入硫酸铵晶体至饱和度为10%~90%，于冰箱中过夜，离心取沉淀，将沉淀加入蒸馏水溶解后，置于透析袋中进行透析，冷冻干燥，即为西兰苔凝集素粗品； (2)称取步骤(1)得到的西兰苔凝集素粗品5(T300mg，溶解于0.5~5 ml，pH为6~9的Tris-HCl缓冲液，用DEAE Sephadex A-52离子交换层析，并用NaCl溶液梯度洗脱，调节流速为0.5 ml/min，每管收集8 min，收集具有凝血活性的第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素样品；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学武，许平平，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44