凝集素芯片在尿蛋白糖链谱分析中的应用制造技术

本发明专利技术涉及凝集素芯片用于区分不同程度的糖尿病肾病。凝集素采用DSA、SBA、GNA和SNA四种凝集素组合对CKD早期及晚期阶段的糖尿病肾病进行快速有效的区分。试剂盒是凝集素芯片试剂盒、包含凝集素的免疫试剂盒。所述试剂盒的检测样品为尿液。本发明专利技术具有以下优点：尿液分析检查有非侵袭性、简单、快速等优点，而且具有安全、无损伤、标本收集简便、容易保存等优点，检测过程灵敏度高、检测结论准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于分析尿蛋白糖链谱的方法，具体涉及凝集素芯片用于区分不同程度的糖尿病肾病。
技术介绍
糖尿病肾病是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症，是糖尿病全身性微血管病变表现之一，临床特征为蛋白尿，渐进性肾功能损害，高血压，水肿，晚期出现严重肾功能衰竭。目前，糖尿病肾病已成为终末期肾脏病的第二位原因，仅次于各种肾小球肾炎。业已成为糖尿病患者的主要死亡原因之一。因此及时防治对于延缓糖尿病肾病的意义重大。目前糖尿病肾病的检测及病程监控指标主要分为以下几个方面：24小时蛋白尿量，内生肌酐清除率，肾小球滤过率（GFR）等。微量白蛋白尿是诊断糖尿病肾病的标志。早期肾病期，也叫微量白蛋白尿期，即尿白蛋白排泄率持续在20～200微克/分钟。临床糖尿病肾病期，尿蛋白逐渐增多，尿白蛋白排泄率超过200微克/分钟，也就是超过300毫克/24小时，相当于尿蛋白总量超过0.5克/24小时。6个月内进行尿液检查，有2～3次尿白蛋白排泄率在20～200微克/分钟之间，就可以诊断早期糖尿病肾病。但是，微量白蛋白尿并不能特异地作为糖尿病肾病的检测依据，它还与糖尿病的其他多种并发症有关，包括高血压、高脂血症、动脉粥样硬化和心血管疾病等。因此出现微量白蛋白尿不一定就代表发生了糖尿病肾病，其出现以后是否必然进展到明显蛋白尿进而慢性肾衰退尚存在争议。在几个较大系列的长期观察中发现有微量白蛋白尿的糖尿病病人，10年中仅有30%～45%转为临床显性蛋白尿，另有30%微量白蛋白尿消失，这在II型糖尿病中更明显。当糖尿病肾病发展到晚期时内生肌酐清除率降低，一般内生肌酐清除率降至10～15ml/min。内生肌酐清除率降低一方面反应肾小球滤过功能减退，另一方面，随着内生肌酐清除率的降低，也表明肾功能损伤程度的加重。早期糖尿病肾病表现为肾小球滤过率增加和B超测量肾体积增大，当糖尿病肾病发展为尿毒症时，GFR（ml·min-1·1.73 m2）减少但肾脏体积无明显缩小。肾功能改变是糖尿病肾病的重要表现，反映肾功能的主要指标是 GFR，根据 GFR 和其他肾脏损伤证据可进行慢性肾病（CKD）的分期，采取不同的治疗方法。GFR>60时，患者处于CKD 的1期，2期，一般认为GFR正常或轻度降低，伴随肾损伤，治疗方面一般采用延缓疾病进展的治疗手段，而当GFR<60时，患者处于CKD 的3期，4期，患者GFR中度或重度下降，一般采用评估和治疗并发症以及肾透析等手段。血清肌本酐在估算 GFR 中存在灵敏度不足，受个体肌肉量、蛋白质摄入、体内代谢水平、溶血、脂血等因素干扰等局限性。因此，亟需一种能够快速、简便、准确的方法用于区分糖尿病肾病不同GFR阶段，以便对糖尿病肾病病程进行监控。
技术实现思路
本专利技术提供一种凝集素芯片用于区分不同慢性肾病分期的糖尿病肾病的方法。本专利技术的技术方案如下：本专利技术通过大量实验研究发现（1）通过对II型糖尿病患者及糖尿病肾病患者尿液的研究发现：凝集素MAL-II识别的Sia2-3Galβ1-4Glc(NAc)糖链结构，凝集素PTL-I，PTL-II，SJA，DBA和SBA识别的末端GalNAc，凝集素AAL识别的α-Fucose结构，凝集素ConA识别的分枝状及末端GlcNAc及Mannose结构，及凝集素SNA识别的Sia2-6Galβ1-4Glc(NAc)糖链结构在糖尿病肾病患者的尿液中丰度较高。而凝集素PSA，UEA-I和STL识别的Fucoseα-1,6GlcNAc，Fucoseα1-2Galβ1-4Glc(NAc)和GlcNAc寡聚体糖链结构在II型糖尿病患者尿液中丰度较高。（2）通过对GFR>60的CKD早期阶段的糖尿病肾病患者及GFR<60的CKD晚期阶段的糖尿病肾病患者尿液的研究发现：凝集素ConA，SNA和RCA120识别的分枝状及末端GlcNAc及Mannose，Sia2-3Galβ1-4Glc(NAc)及β-gal糖链结构在CKD早期阶段的糖尿病肾病患者尿液中的丰度较高；凝集素DSA识别的GlcNAc糖链结构在CKD早期及晚期阶段的糖尿病患者尿液中的丰度基本相同；而凝集素SBA，BS-I和DBA识别的末端GalNAc结构及凝集素GNA识别的末端α-1,3 mannose糖链结构在GFR>60的CKD早期阶段的糖尿病肾病肾病患者尿液中丰度较高。综合以上研究及申请人的进一步筛选，申请人提出了采用DSA、SBA、GNA和SNA四种凝集素组合对CKD早期及晚期阶段的糖尿病肾病进行快速有效的区分。凝集素在制备区分CKD早期及晚期阶段的糖尿病肾病的试剂盒中的应用：所述凝集素选自DSA、SBA、GNA、和SNA组成的组。所述试剂盒是凝集素芯片试剂盒、包含凝集素的免疫试剂盒。所述凝集素芯片试剂盒的制备方法入下：1）取环氧化片基备用；2）对应于尿液样本，选取以下4种凝集素SBA、GNA、DSA和SNA配制成浓度为1mg/ml的点样液；3）将配制得到的点样液加到384孔板内；再使用芯片点样仪器将上述凝集素点样液点制在环氧化片基上制备成芯片；4）将点制好的芯片在湿度为60%-70%的环境中避光孵育12小时；5）将孵育后的芯片在37℃条件下抽真空干燥，使点制在芯片表面的凝集素充分固定在芯片上；6）将固定好的凝集素芯片放置于干燥器中4℃避光保存，作为尿液样本检测的凝集素芯片。所述试剂盒的使用方法如下：1）对尿液样本原液进行预处理，提取纯化尿蛋白，用荧光试标记剂进行标记，并用Sephadex G-25纯化柱去除未与尿蛋白结合的荧光，得到相应的尿蛋白待检测样本；2）将尿蛋白待检测样本与制备好的凝集素芯片共孵育以获得样本中糖蛋白糖链谱:2.1）将1%牛血清白蛋白组分V溶解于磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中；2.2）将封闭后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤2.1）中未与芯片共价结合的凝集素及残留的牛血清白蛋白组分V，再经甩干后备用；2.3）对经步骤2.2）甩干后的凝集素芯片加入3-5μg待检测样本和500-600μL的孵育缓冲液，室温孵育；2.4）将孵育后的凝集素芯片依次用10mM磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤2.3）中未与凝集素芯片特异结合的待检测样本蛋白，再经甩干后备用；2.5）对经步骤2.4）甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后尿蛋白糖链结合的荧光图像；2.6）通过GenePix6.0软件对荧光图像进行数据分析。所述步骤2.1）、2.2）和2.4）中的磷酸盐缓冲液pH7.4，含有NaCl 8.0g/L，KCl 0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO4•12H2O 2.9g/L；磷酸盐缓冲液-吐温20：10mmol/L 磷酸盐缓冲液中含质量分数0.05-0.5%吐温20。所述步骤2.3）中的孵育缓冲液：磷酸盐缓冲液-吐温20中含质量分数1%牛血清白蛋白组分V和质量分数5-10%羟胺。所述荧光试剂采用Cy3。所述步骤1.3）所述点样仪器采用晶芯smartarrayer 48点样系统。所述步骤2.3）是对甩干后的凝集素芯片本文档来自技高网...

【技术保护点】
凝集素芯片在尿蛋白糖链谱分析中的应用，其特征在于所述凝集素选自由DSA、SBA、GNA和SNA组成的组。

【技术特征摘要】
1.凝集素芯片在尿蛋白糖链谱分析中的应用，其特征在于所述凝集素选自由DSA、SBA、GNA和SNA组成的组。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：试剂盒是凝集素芯片试剂盒、包含凝集素的免疫试剂盒。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述试剂盒的检测样品为尿液。4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述凝集素芯片试剂盒的制备方法入下：1）取环氧化片基备用；2）对应于尿液样本，选取以下4种凝集素DSA, SBA, GNA和SNA配制成浓度为1mg/ml的点样液；3）将配制得到的点样液加到384孔板内；再使用芯片点样仪器将上述凝集素点样液点制在环氧化片基上制备成芯片；4）将点制好的芯片在湿度为60%-70%的环境中避光孵育12小时；5）将孵育后的芯片在37℃条件下抽真空干燥，使点制在芯片表面的凝集素充分固定在芯片上；6）将固定好的凝集素芯片放置于干燥器中4℃避光保存，作为尿液样本检测的凝集素芯片。5.如权利要求4所述应用，其特征在于所述试剂盒的使用方法如下：1）对尿液样本原液进行预处理，提取纯化尿蛋白，用荧光试标记剂进行标记，并用Sephadex G-25纯化柱去除未与尿蛋白结合的荧光，得到相应的尿蛋白待检测样本；2）将尿蛋白待检测样本与制备好的凝集素芯片共孵育以获得样本中糖蛋白糖链谱:2.1）将1%牛血清白蛋白组分V溶解于磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中；2.2）将封闭后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤2.1）中未与芯片共价结合的凝集素及残留的牛血清白蛋白组分V，再经甩干后备用；2.3）对经步...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱晗玉，张冬，于汉杰，李铮，刘沫言，耿文佳，陈香美，蔡广研，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，西北大学，
类型：发明
国别省市：北京;11