一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法技术

本发明专利技术提供一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法，以快速、简便、准确检测肝肿瘤的替代生物标志物的表达信息。该方法主要步骤有：1)制备分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片；2)分别对唾液、血清和尿液样本原液进行预处理，去除杂质，纯化蛋白，用荧光试剂进行标记，并用G-25柱去除多余荧光，得到相应的待检测样本；3)将三种待检测样本分别加载到对应的凝集素芯片上以获得各待检测样本中糖蛋白糖链谱，根据其中任一待检测样本的反应结果即得出所述替代生物标志物的信息。本发明专利技术检测过程灵敏度高、检测结论准确，具有安全、无损伤、标本收集简便、容易保存等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测肿瘤的替代生物标志物的方法，具体涉及在唾液、血清和/ 或尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法。
技术介绍
目前，在临床上缺乏灵敏、特异的早期肝癌诊断标志物，能检测出的早期肝癌病例大约占所有肝癌病例的25%。尽管已经发现了很多可以作为肝癌诊断标志物的生物大分子，但是这些标志物检测的结果仍旧停留在对晚期肝癌的诊断。甲胎蛋白(AFP)是目前肝癌诊断的特异性指标，但AFP测定存在假阳性和假阴性的问题。约20%的晚期肝癌病人，直至病故前，AFP测定仍为阴性。而在肝癌治疗方面也未找到特异、有效的分子靶点。因此， 寻找和发现新的肝癌标志物和治疗靶点用于肝癌早期诊断和治疗显得尤为重要。目前对于原发性肝癌经过抽血化验，有4项指标可提供有价值的诊断。血清学检测结合影像学检查使肝癌在亚临床期(还没有出现症状)即可做出诊断，从而明显提高了肝癌的远期疗效。目前医院常用诊断肝癌血清指标有以下几种甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(AP)、Y-谷氨酰转移酶同工酶II (GGD)及血清岩藻糖苷酶(AFU)。甲胎蛋白(AFP)甲胎蛋白是1956年在胎儿血清中发现的一种胚胎专一性甲种球蛋白，1964年有人在肝癌患者血清中测得它。参考值<20yg/L。临床意义正常情况下， 这种存在于胚胎早期血清中的甲胎蛋白在出生后即迅速消失，如重现于成人血清中，则提示有肝癌的可能。另外，在生殖腺胚胎瘤和少数转移性肿瘤如胃癌，以及在孕妇、肝炎、肝硬化患者血清中甲胎蛋白可呈假阳性，但升高不如肝癌明显。甲胎蛋白现已广泛用于肝细胞癌的普查、诊断、判断治疗效果、预测复发。普查中阳性可早于症状出现8 11个月。甲胎蛋白对肝细胞癌的临床价值可以归纳为①是一种仅次于病理检查的诊断方法；②为目前最好的早期诊断方法之一，可在临床症状出现前8 11个月做出诊断；③为反映病情变化和治疗效果的敏感指标；④有助于检出亚临床期、复发性与转移性肝癌。异常凝血酶原(AP)异常凝血酶原也称Y -羧基凝血酶原。参考值< 250微克/ 升。临床意义肝癌患者血清异常凝血酶原阳性率为69.4%。多数资料表明，异常凝血酶原对原发性肝癌有较高的特异性，而良性肝病、转移性肝癌仅少数呈阳性，因此对亚临床肝癌有早期诊断价值。γ -谷氨酰转移酶同工酶II (GGT2) γ -谷氨酰转肽酶同工酶II对原发性和转移性肝癌诊断的阳性率可达90%，特异性达97. 1 %，非癌性肝病和肝外疾病患者的阳性率小于5%。Y-谷氨酰转肽酶同工酶II与甲胎蛋白浓度无关，在甲胎蛋白低浓度和假阴性肝癌患者中，Y-谷氨酰转肽酶同工酶II的阳性率也较高。血清岩藻糖苷酶(AFU)参考值3. 5 10. 3单位/升(U/L)。国内报道，血清岩藻糖苷酶诊断原发性肝癌的阳性率为70% 80%，该指标阳性与甲胎蛋白浓度及肿瘤大小无关。血清岩藻糖苷酶对甲胎蛋白阴性肝癌和小肝癌患者的阳性率分别为76. 和70. 8%0对转移性肝癌和肝良性肿瘤均为阴性，但肝硬化、慢性肝炎患者出现假阳性率较高。甲胎蛋白、Y-谷氨酰转肽酶同工酶II、异常凝血酶原对肝癌有肯定的诊断价值， 在普查中也有早期诊断意义。Y-谷氨酰转肽酶同工酶II和异常凝血酶原若与甲胎蛋白联合检测，则可大大提高诊断准确率。血清岩藻糖苷酶对肝癌有一定的诊断价值，但特异性不高，若与甲胎蛋白联合检测，可用做甲胎蛋白阴性肝癌患者的辅助诊断。目前发现人的唾液中有1166种蛋白质。其中大部分蛋白质能同时在血浆和泪液中找到。从这些蛋白质中可以找到与心血管疾病、癌症、肾脏病等疾病相关的生物标志物， 从而为今后的临床诊断提供一种非侵袭性新方式。如在不久前发表于《蛋白组学研究杂志》 [J Proteome Res 2009,8(1) :239]的一项研究证实，唾液蛋白质与2型糖尿病相关。通过对2型糖尿病患者和对照者的唾液蛋白组学分析，发现了唾液中487种与2型糖尿病有关的蛋白。其中33%的蛋白以前从未被报告出现在人类唾液中。在这些蛋白中，有65种蛋白的水平在患者和对照者唾液中能相差2倍之多。进一步分析显示，一些蛋白水平在2型糖尿病患者的唾液中显著升高，在糖尿病前期患者中也有相应升高趋势，因此，可能作为未来无创诊断2型糖尿病和发现糖尿病前期患者的生物标志物。科学家们通过一项动物研究，试图挖掘唾液中蛋白随肿瘤改变的机制。在癌症模型小鼠中肿瘤与唾液中蛋白水平改变相关，推测肿瘤和内分泌器官一样，可以分泌激素、淋巴因子和细胞因子，通过血液运输到远端器官，对其产生影响。一旦这些因子到达唾液腺， 则唾液中的基因转录谱会发生改变，导致某些蛋白的丰度或种类改变。这些丰度或种类改变的蛋白将可能成为唾液中检测肿瘤的替代生物标志物。研究者在黑色素瘤和非小细胞肺癌的模型小鼠以及对照小鼠中比较了唾液中转录因子水平的差异。结果发现，肿瘤小鼠与正常小鼠相比，其唾液中转录组学改变显著。进一步分析显示，转录组学某些改变在肿瘤组织、血液、唾液腺和唾液中均存在。目前，相关的替代生物标志物的检测仍处于试验研究，检测灵敏度、结论准确性不高，检测方法需要高度专业、复杂的检测操作才能够实现；因此，亟需一种能够快速、简便、 准确检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法。
技术实现思路
本专利技术提供，以快速、简便、准确检测肝肿瘤的替代生物标志物的表达信息。本专利技术的技术方案如下，包括以下步骤1)制备分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片1. 1)取环氧化片基备用；1. 2)对应于唾液样本，选取以下12种凝集素1 4、441^、1^^120、？拟4、1^1、^^、 SNA、MAL-II、BS-I、PTL-II、SBA和GNA中的至少四种配制成浓度为0. l-10mg/ml的点样液；对应于血清样本，选取以下9种凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、SJA、PTL-II、ECA、P^ 和GNA中的至少四种配制成浓度为0. l-10mg/ml的点样液；对应于尿液样本，选取以下7种凝集素HHL、AAL、GSL-I, PSA、RCA120, DSA和WGA中的至少四种配制成浓度为0. l-10mg/ml的点样液；1. 3)将配制得到的点样液加到384孔板内；再用点样仪器在环氧化片基上点样得到芯片；1. 4)将点制好的芯片在湿度为55% -65%的环境中孵育2. 5-3. 5小时；1. 5)对孵育好的芯片在37°C的环境中抽真空使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；1. 6)将固定好的凝集素芯片放置于干燥器中以备用，作为分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片；2)分别对唾液、血清和尿液样本原液进行预处理，去除杂质，纯化蛋白，用荧光试剂进行标记，并用G-25柱去除多余荧光，得到相应的待检测样本；3)将三种待检测样本分别加载到对应的凝集素芯片上以获得各待检测样本中糖蛋白糖链谱，根据其中任一待检测样本的反应结果即得出所述替代生物标志物的信息；对于任一待检测样本，具体操作步骤如下3. 1)将1-2%牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中；3. 2)将封闭后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液清洗， 以去除步骤3. 1)中未完全固定于芯片上的凝集素，再经甩干后备用；3. 3)对本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法，包括以下步骤：１）制备分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片１．１）取环氧化片基备用；１．２）对应于唾液样本，选取以下１２种凝集素ＷＦＡ、ＡＡＬ、ＲＣＡ１２０、ＰＨＡ－Ｅ、ＬＴＬ、ＬＣＡ、ＳＮＡ、ＭＡＬ－ＩＩ、ＢＳ－Ｉ、ＰＴＬ－ＩＩ、ＳＢＡ和ＧＮＡ中的至少四种配制成浓度为０．１－１０ｍｇ／ｍｌ的点样液；对应于血清样本，选取以下９种凝集素ＨＨＬ、ＡＡＬ、ＧＳＬ－Ｉ、ＰＳＡ、ＳＪＡ、ＰＴＬ－ＩＩ、ＥＣＡ、ＰＷＭ和ＧＮＡ中的至少四种配制成浓度为０．１－１０ｍｇ／ｍｌ的点样液；对应于尿液样本，选取以下７种凝集素ＨＨＬ、ＡＡＬ、ＧＳＬ－Ｉ、ＰＳＡ、ＲＣＡ１２０、ＤＳＡ和ＷＧＡ中的至少四种配制成浓度为０．１－１０ｍｇ／ｍｌ的点样液；１．３）将配制得到的点样液加到３８４孔板内；再用点样仪器在环氧化片基上点样得到芯片；１．４）将点制好的芯片在湿度为５５％－６５％的环境中孵育２．５－３．５小时；１．５）对孵育好的芯片在３７℃的环境中抽真空使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；１．６）将固定好的凝集素芯片放置于干燥器中以备用，作为分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片；２）分别对唾液、血清和尿液样本原液进行预处理，去除杂质，纯化蛋白，用荧光试剂进行标记，并用Ｇ－２５柱去除多余荧光，得到相应的待检测样本；３）将三种待检测样本分别加载到对应的凝集素芯片上以获得各待检测样本中糖蛋白糖链谱，根据其中任一待检测样本的反应结果即得出所述替代生物标志物的信息；对于任一待检测样本，具体操作步骤如下３．１）将１－２％牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液－吐温２０中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中；３．２）将封闭后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液－吐温２０和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤３．１）中未完全固定于芯片上的凝集素，再经甩干后备用；３．３）对经步骤３．２）甩干后的凝集素芯片加入３－５μｇ待检测样本和５００－８００μＬ的孵育缓冲液，室温孵育；３．４）将孵育后的凝集素芯片依次用磷酸盐缓冲液－吐温２０和磷酸盐缓冲液清洗，以去除步骤３．３）中未完全结合于凝集素芯片上的待检测样本的蛋白，再经甩干后备用；３．５）对经步骤３．４）甩干后的凝集素芯片用ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白糖链结合的荧光图像；３．６）通过ＧｅｎｅＰｉｘ３．０软件对荧光图像进行中值分析，对图像中的凝集素所对应的糖链结构反复核对后得出所述替代生物标志物的表达信息。...

【技术特征摘要】
1. 一种在唾液、血清和尿液中检测肝肿瘤的替代生物标志物的方法，包括以下步骤1)制备分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片 1.1)取环氧化片基备用；1. 2)对应于唾液样本，选取以下12种凝集素1 4、441^、1^^120、？拟4、1^1、^^、5嫩、 MAL-II、BS-I、PTL-II、SBA和GNA中的至少四种配制成浓度为0. l-10mg/ml的点样液；对应于血清样本，选取以下9种凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、SJA、PTL-II、ECA、PWM和 GNA中的至少四种配制成浓度为0. l-10mg/ml的点样液；对应于尿液样本，选取以下7种凝集素HHL、AAL、GSL-I、PSA、RCA120, DSA和WGA中的至少四种配制成浓度为0. l-10mg/ml的点样液；1.3)将配制得到的点样液加到384孔板内；再用点样仪器在环氧化片基上点样得到芯片；1. 4)将点制好的芯片在湿度为55% -65%的环境中孵育2. 5-3. 5小时；1.5)对孵育好的芯片在37°C的环境中抽真空使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上； 1.6)将固定好的凝集素芯片放置于干燥器中以备用，作为分别对应于唾液、血清和尿液样本检测的凝集素芯片；2)分别对唾液、血清和尿液样本原液进行预处理，去除杂质，纯化蛋白，用荧光试剂进行标记，并用G-25柱去除多余荧光，得到相应的待检测样本；3)将三种待检测样本分别加载到对应的凝集素芯片上以获得各待检测样本中糖蛋白糖链谱，根据其中任一待检测样本的反应结果即得出所述替代生物标志物的信息；对于任一待检测样本，具体操作步骤如下3. 1)将1-2%牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李铮，于汉杰，朱珉之，秦棪楠，简强，张华，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：87