一种以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的扩增、冻存及复苏方法技术

本发明专利技术公开了一种以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的培养、冷冻及复苏方法，可以解决患者为连续使用活化的CD3+CD8+为主的淋巴细胞而需多次采血的问题。其包括：（1）通过将外周血样提取出的淋巴细胞与IL-2，IL-15，抗CD3抗体，抗CD28抗体接触，以扩增活化的以CD3+CD?8+为主活化淋巴细胞；（2）活化淋巴细胞的冻存；（3）活化淋巴细胞的复苏。本发明专利技术所培养的活化淋巴细胞成分清晰，CD4+CD25+Treg细胞含量极少，并含有大量的CD8+T淋巴细胞，可以根据病人其他治疗如放疗化疗来调整活化淋巴细胞的回输时间和次数，以更好的治疗肿瘤，感染性疾病以及免疫缺陷症等疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及活化淋巴细胞的扩增、冻存以及复苏方法，属于生物

技术介绍
机体的免疫系统具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力，已经获得了大量研究数据的证实。近年来，肿瘤特异性细胞免疫治疗在临床实践中显示了非常令人兴奋的疗效。2002年，RosenbergSA等人在Science杂志报道了利用体外大量扩增的肿瘤特异性肿瘤浸润淋巴细胞过继回输方法，他们在体外筛选出具有病人自身恶黑细胞特异性杀伤作用的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，大量扩增后回输给自体病人。在这种方法中，经过体外IL-2和抗⑶3抗体 的联合作用，数量高达1011的、肿瘤细胞高度特异的多种肿瘤抗原特异性识别的TILs被回输至经清除淋巴细胞化疗的病人体内，这些细胞以⑶3+⑶8+⑶56-的T细胞为主。在接受治疗的13例病人中，6例病人完全缓解(CR，肿瘤完全消失)，4例病人部分缓解(PR，肿瘤消失50%以上,无新发肿瘤)。这10例病人均发生明显的肿瘤缩小和/或消失。在Dr. Rosenberg的长期临床实践中，他们发现，利用来源于肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞进行晚期恶性黑色素瘤的治疗，其有效率可达50%以上。Greenberg和Yee C的研究组在利用具有肿瘤特异性杀伤能力的CD8+T细胞克隆进行的治疗中发现，多次使用这类细胞、联合使用化疗药或不使用化疗药进行晚期恶性黑色素瘤病人的治疗，可以使部分病人肿瘤长期稳定、明显延长病人生存期。然而，在这些特异性细胞免疫治疗过程中，存在着特异性细胞培养扩增的技术难题。首先，对于肿瘤浸润淋巴细胞来说，(I)需要解决肿瘤组织体外原代培养的技术难题，以鉴定所获得的肿瘤浸润淋巴细胞对自体肿瘤有杀伤能力；(2)对于生命关键性器官所发生的肿瘤，需要鉴定特异性浸润T淋巴细胞所识别是否为组织相关性抗原，以避免自身免疫病的发生。所谓组织相关性抗原，指的是在肿瘤中高表达，在正常对应的组织器官中低表达的肿瘤抗原。在免疫治疗黑色素瘤时，可能会发生白癜风的副作用，而对如肝、脑等生命重要器官，由于这类抗原诱导的特异性杀伤细胞所可能产生的自身免疫病，使肿瘤浸润淋巴细胞进行特异性免疫治疗的应用受到限制。其次，对于使用抗原和树突状细胞(DC)进行体外肿瘤抗原特异性的淋巴细胞克隆来讲，(I)需要通过Ieukophresis获取大量的外周血单个核细胞以获得DC和饲养细胞；(2)每一个目的抗原均须进行体外抗原刺激，以获得肿瘤特异性T细胞克隆，技术复杂、耗时长、细胞用量大，限制了多种抗原特异性T细胞的获得。另外，活化的淋巴细胞需多次输注才能达到较好的治疗效果，多数医疗单位利用血细胞分离机采集单个核细胞，而这种采集方法价格昂贵，多次采集给患者带来心理及身体的痛苦。如果一次采集的单个核细胞可以冻存，当患者治疗需要时，复苏并诱导为活化的淋巴细胞，就为患者节约了费用，减轻了痛苦。传统的体外扩增淋巴细胞的方法，是以CD3抗体作为淋巴细胞激活剂，并采用大剂量的IL-2，这样虽然在短期内得到大量活化的T细胞，但很容易导致活化诱导的细胞死亡，最终难以获得足够数量的细胞毒性T淋巴细胞，并且含有大量的⑶4+⑶25+Treg细胞(见具体实施方式14)。小剂量的抗⑶3单抗可以活化静止的T细胞，诱导其产生杀伤肿瘤的作用，这种杀伤作用既包括对肿瘤细胞的直接杀伤，又包括分泌相关的细胞因子对肿瘤细胞产生间接杀伤，还可通过诱导肿瘤细胞发生凋亡对其产生作用。另一方面加入抗⑶3单抗后可以激活肿瘤细胞的凋亡途径，导致凋亡细胞的数量增加，而这种凋亡作用主要通过Fas途径产生。但大剂量加入CD3单抗进行培养时并未产生直线增加的杀伤和诱导作用，相反出现凋亡数量下降的现象，甚至出现对T细胞的抑制作用，坏死及凋亡细胞的数量均下降，这可能是因为T细胞受体(TCR)的数量有限，在过量的抗CD3单抗作用下，不但不能激活T细胞，反而会因受体表面被封闭而无法活化。
技术实现思路
为了解决了现有活化淋巴细胞制备(主要是指CIK细胞)纯度低，增殖力低的缺 点。并解决病人因为多次使用细胞而需多次采血的问题。本专利技术联和使用抗CD3单抗、抗CD28单抗、IL-2、IL-15等共同培养，另外通过免疫磁珠技术去除在培养过程中产生的CD4+CD25+Treg细胞，使得培养的细胞种类纯度更高。本专利技术冻存以及复苏的方法，可以解决患者为连续使用活化的⑶3+⑶8+为主的淋巴细胞而需多次采血的问题。我们在使用本专利技术所培养的活化的淋巴细胞治疗的临床观察，在多名患者中，观察到肿瘤的长期稳定、配合化疗肿瘤的明显缩小等现象。这种现象，与肿瘤特异性细胞免疫治疗观察到的效果类似。同时，活化的淋巴细胞群体中CD8+T淋巴细胞百分比越高，治疗效果越好。因此，我们怀疑在这些“非特异性免疫细胞”中，可能存在肿瘤特异性CD8+杀伤性T淋巴细胞，发挥了其抗肿瘤效果。人体内T淋巴细胞包括许多针对不同抗原的特异性细胞，这些细胞经过培养后，理论上他们会针对不同的肿瘤抗原或病毒抗原具有广泛的识别和杀伤效果。⑶28分子又称TP44，是一种包括202个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。可以提供T细胞活化所需的共刺激信号，促进T细胞活化增殖。利用CD28单抗作为CD28的配体，以CD3单抗激活TCR信号途径，可有效地增强⑶3AK细胞的增殖活性，并延缓⑶3AK细胞的凋亡。⑶28共刺激使外周血淋巴细胞活化显著促进细胞因子产生，⑶28单抗协同⑶3单抗可明显提高外周血淋巴细胞上清中IFNy、IL-2、IL-4水平，并且CD28单抗能抑制IFNy、IL_2、肿瘤坏死因子(TNF)等的mRNA降解IL-2是主要由活化的T细胞分泌的重要的细胞生长因子。它最初是从丝裂原刺激的淋巴细胞的培养上清中纯化出来的，是调节T淋巴细胞应答的一种重要的细胞因子。在抗原活化后，能促进T细胞的增值，但是在后期，随着活化T细胞数量的增多和IL-2的浓度的逐渐升高，T细胞便很快地进入Fas/FasL介导的的活化诱导的细胞死亡(AICD)。，因此单纯使用IL-2并不能是T细胞在体外较长时间的扩增IL-15也是一种重要的细胞生长因子，它主要由单核细胞和树突状细胞表达分泌，能够促进NK细胞，T细胞和B细胞的增殖和分化。IL-15是由能够刺激IL-2依赖的T细胞系的增殖，而且这种增殖效应不能被anti-IL-2抗体所阻断。因此IL-15与IL-2具有相似的生物学效应，即两者都能促进T细胞的分化增值，然而，与IL-2不同的是，IL-15受体结合后，能够稳定rc链，且上调抗凋亡基因bcl-2，从而表现有抗AICD和延长细胞存活时间的作用。⑶4+⑶25+Treg细胞是自然产生并成熟于胸腺的独特细胞群，占⑶4+T细胞5% —10%。它可通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身反应性T细胞的活化，维持自身免疫耐受，防止自身免疫病的发生。⑶4+⑶25+Treg细胞主要在机体免疫系统中发挥负向调节作用，既能抑制不恰当的免疫反应，又能限定免疫应答的范围、程度及作用时间，对效应细胞的增殖、免疫活性的发挥起抑制作用。抑制性表现在Treg 细胞能够抑制许多免疫细胞的活性、增殖及功能，如⑶4+Th细胞、⑶8+细胞毒性T细胞、⑶Id限制性NKT细胞、单核/巨噬细胞、初始/记忆B细胞和树突状细胞(DCs)等。经TcR介导的信号刺激可以是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的扩增方法，其特征是，（a）将外周血血样中分离出的单个核细胞在含有淋巴细胞激活剂和细胞因子IL？2的培养基中培养；所述淋巴细胞激活剂为抗CD3抗体和抗CD28抗体，抗CD3抗体的终浓度为0.1？100ng/ml；抗CD28抗体的终浓度为0.1？50ng/ml；所述IL？2终浓度为100U/ml至5000U/ml；（b）将（a）步骤中培养得到的淋巴细胞用mini？MACS磁珠分选去除CD4+CD25+Treg细胞；（c）将（b）步骤中培养得到的淋巴细胞在含有细胞因子IL？2和IL？15的培养基中培养；所述IL？2终浓度为50？500U/ml，IL？15的终浓度为10？500ng/ml；（d）收集（c）步骤中得到的淋巴细胞用于回输或冻存。

【技术特征摘要】
1.ー种以⑶3+⑶8+为主的活化淋巴细胞的扩增方法，其特征是， Ca)将外周血血样中分离出的单个核细胞在含有淋巴细胞激活剂和细胞因子IL-2的培养基中培养；所述淋巴细胞激活剂为抗CD3抗体和抗CD28抗体，抗CD3抗体的终浓度为O. l-100ng/ml ;抗CD28抗体的终浓度为O.ト50ng/ml ;所述IL-2终浓度为100U/ml至5000U/ml ； (b)将(a)步骤中培养得到的淋巴细胞用miniMACS磁珠分选去除CD4+CD25+Treg细胞； (c)将(b)步骤中培养得到的淋巴细胞在含有细胞因子IL-2和IL-15的培养基中培养；所述IL-2终浓度为50-500U/ml，IL-15的终浓度为10_500ng/ml ； (d)收集(c)步骤中得到的淋巴细胞用于回输或冻存。2.如权利要求I所述的扩增方法，其特征是，所述步骤(a)抗CD3抗体的终浓度为l-75ng/ml，抗 CD28 抗体的终浓度为 2_30ng/ml ;IL_2 的浓度为 2000_4000U/ml。3.如权利要求I所述的培养方法，其特征是，步骤(c)中IL-2的终浓度为200-500U/ml，IL-15 的终浓度为 200-400ng/ml。4.如权利要求I所述的扩增方法，其特征是，所述步骤(a)中使用的淋巴细胞激活剂还含有激活剂PHA和/或IFN-r ;所述PHA的终浓度为l-100ng/ml，而IFN_r的终浓度为100-2000U/ml。5.如权利要求I所述的扩增方法，其特征是，所述步骤(c)还含有细胞因子IL-7、IL-12、IL-21中的ー种或几种；所述IL-7的终浓度为10_200ng/ml，IL-12的终浓度为5-100ng/ml, IL-21 的终浓度为 l_200ng/ml。6.如权利要求I所述的扩增方法，其特征是，所述培养基为RPMI-1640培养基、DMEM培养基或者AIM-V培养基。7.权利要求1-6中任意一项所扩增的以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的冻存方法，其特征是， Ce)取权利要求1-6的生长在对数期的以⑶3+⑶8+为主的活化淋巴细胞进行收集，收集方法为以300-2000r/min的速度离心，得到沉淀细胞； (g)将在(e)步骤中得到的细胞加入冻存液使细胞浓度为O.lX 107-5X 107/ml ;将制备的细胞悬液转入冻存管中； (h)将(g)步骤中得到的冻存管放于程序降温盒中在零下20°C放置1-5小时，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：高恒亮，郭栋，
申请(专利权)人：济南泰生生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：