利用促细胞分裂原和抗原测定淋巴细胞活化的方法技术

本发明专利技术提供了在共刺激剂有或无的情况下，检测淋巴细胞功能及其对促细胞分裂原或对特异抗原反应的方法。本方法适用于检测淋巴细胞当其作为细胞亚群时的反应，也适用于检测淋巴细胞特异亚型、在其细胞表面具有特征决定簇的各亚群或亚群的亚型的功能。本发明专利技术也涉及到此方法使用的试剂盒。本发明专利技术方法利于筛选复合生物流体，如全血，是将流体样品与促细胞分裂原或抗原一起温育，加入或不加共刺激元素，用诸如亲和分离的方法分离出所选择的目的亚型，以及检测胞内成分优先是ＡＴＰ的存在，其作为反应结果有所增加。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术涉及快速检测淋巴细胞的功能及其对促细胞分裂原或者特异抗原的反应的方法。具体而言，本方法可快速检测胞内成分优先ATP的存在，ATP作为免疫反应结果有所增加。
技术介绍
免疫系统是感染性疾病和癌症的控制中心。淋巴细胞是一类白细胞，为负责免疫系统活性的重要细胞类型。淋巴细胞分为两大主要类别，T淋巴细胞和B淋巴细胞。总体评价免疫系统具体为淋巴细胞的功能对于评价免疫缺损很是重要的，免疫缺损由遗传因素、感染性疾病例如HIV、移植后药物、紧张、衰老或营养缺乏导致。淋巴细胞表达位于细胞表面的受体，其与特异抗原或表位结合。与抗原接触使得与抗原反应的淋巴细胞的种群扩展。检测免疫系统对特异抗原的反应，可用于诊断传染性疾病、对某些药剂的高敏感性、与免疫活性药物的接触或对接种的反应。通过检测诸如血液、唾液或尿液的体液中特异抗体的水平可来评估B淋巴细胞的功能或其对特异抗原的反应。很难检测T淋巴细胞(T细胞)的功能或其对特异抗原的反应。许多原因使得检测T细胞的功能复杂化了。首先，T细胞有许多不同亚型，各具不同功能。这些亚型部分是根据特征细胞表面标记的表达分类，部分是根据各种功能分析包括细胞因子测试来分类。其次，T细胞只有在呈递细胞表面上的主要组织相容性抗原的情形下由其他细胞呈递时才会对抗原作出反应。再次，T细胞的许多功能依赖于与效应细胞的细胞-细胞接触，或者其功能相当局部化。现有的检测免疫功能方法很烦锁、费时，并且不能很好地适用于临床实验室安装。目前使用的直接或间接检测免疫功能的方法包括基于对淋巴细胞或不同亚型计数的方法、基于检测淋巴细胞增生的方法，基于检测细胞毒素活性或细胞因子分泌的方法以及体内皮试或适用的转移方法。文献中详细叙述了这些方法(参见例如Groeneveld等，Joournal of the International Federation of Clinical Chemistry，684-94；1994；Clough和Roth，JAVMA 2061208-1216.1995)。临床实验室最常用的方法是计算淋巴细胞或亚型的数目。已描述的各种技术包括免疫荧光显微镜技术、免疫细胞化学、酶联免疫测定以及流式细胞仪。特别地，流式细胞仪广泛用于临床实验室装置中，以及特别有利于检测细胞的复合种群中的目的亚型。例如，Recktenwald的美国专利号4,727,020描述了运用两个荧光通道检测亚群中特异标记有两种不同免疫荧光剂的细胞。Hansen等的美国专利号4,284,412叙述了运用荧光通道来检测血液中不同亚群细胞散射的正方和右方角的光线。流式细胞仪的主要缺点包括其需要复杂、昂贵的仪器，需要显著的“传递”时间，因为每个样品要经历许多人手工步骤，必须使用高级技术人员分析结果。临床实验室每天要测量许多患者的样品，一致、可靠的测定结果对于临床实验室十分重要，但这些缺点对于上述临床实验室来说尤其棘手。Melnicoff等的美国专利号5,385,822和Jensen的美国专利号5,374,531公布了另一种流式细胞仪方法，用于计算淋巴细胞的数目，或计算细胞混合种群内淋巴细胞亚型的数目。这些专利中描绘的方法涉及到将可检测的报道物质偶联到生物膜上或将报道物质掺入细胞，然后分离亚型或目的种群，并检测报告物质。这些方法运用亲和层析来分离形成细胞复杂混合物的目的种群。尽管该技术在流式细胞仪上作了改进，但仍基于细胞计数技术。所有细胞计数技术的主要困难在于它们不能检测特异细胞的功能及其对特异或非特异刺激物的反应，如特异抗原或促细胞分裂原。进而这些方法反映了细胞表面抗原的结合特性。此外，这些方法烦琐且重复性差。对淋巴细胞应答直接检测包括淋巴增生分析、细胞毒性分析以及细胞因子检测。一般来说，这些方法需要从原始样品中分离出白细胞，接着与抗原或促细胞分裂原温育。特异亚型功能检测需要在实验前广泛操作。例如，需要抗原呈递细胞，这表示淋巴细胞要把额外细胞加回到培养物中。淋巴增生分析是基于反应细胞的分裂，并通常采用放射性同位素来完成。因为他们要评价细胞小种群的分裂并需要组织培养物，测试用3-10天完成，而且基于特殊技术和测试中所用试剂带来显著的不稳定性。细胞毒性测试也需要显著的细胞操作，并依赖于所用的特异条件带来同样的高度不稳定性。也可以进行细胞因子分析，但步骤很多，并在刺激细胞前分离目的亚型。McMichaels的美国专利号5,344,755描述了基于起初T淋巴细胞的免疫磁性分离而改进的细胞毒性分析方法，但这一方法仍需广泛操作效应细胞。美国专利号5,344,755提供了运用细胞因子检测方法来评价HIV阳性患者中免疫状况的示例，但其烦琐，需要多种步骤。这些方法需要分离关键细胞类型、长时间温育并在一些情况下使用放射性物质。基于这些原因，这些方法不适用于临床应用。最近，运用流式细胞仪通过胞内细胞因子的表达来检测对抗原或促细胞分裂原刺激的应答(例如，美国专利5,445,393；5,656,446；5,843,659)。由于细胞因子通常由对刺激产生应答的细胞所释放，基于流式细胞仪的方法需要往培养基中添加布雷菲尔德菌素来抑制释放细胞因子，这样来进行非生理性分析测试。此外，细胞需要多重温育、离心步骤和洗涤以刺激、抑制细胞因子释放、通透细胞、结合细胞表面标记、固定并染色细胞，以通过流式细胞仪而可见。细胞亲和层析运用蛋白包被的磁性颗粒或诸如聚苯乙烯颗粒的其他类型固相支持物，此方法是已知的，并在上述方法若干种中部分运用，参见美国专利号5,374,531、5,385,822和5,344,755。专利文献或其他中描绘了通过在固相支持物上的亲和层析分离来挑选生物群体的方法，参见例如美国专利号3,970,518、4,710,472、4,677,067、4,666,595、4,230,685、4,219,411、4,157,323；也参见，E.T.Menz等，Am.Biotech.Lab.(1986)；J.S.Kemshead等，Molec.Cell.Biochem.，6711-18(1985)；T.Leivestag等，Tissue Antigens，2846-52(1986)；以及J.S.Berman等，J.Immunol.，1382100-03(1987)。在执行这些方法过程中，结合分子(如单克隆抗体)通常结合到如磁性颗粒或塑料珠子的固相支持物上，并在特定条件下加入到样品中，所述条件导致结合到目的分析物上的特征决定簇。然后通过与磁场接触或过滤或某些其他合适的方法，将用固相支持物复合的细胞从未复合的细胞分离，这取决于固相支持物的性质。已有报道，应用这种技术在移植前从骨髓细胞中分离淋巴细胞亚群，以及消除移植后针对宿主的疾病。参见A.Butturini等，Prog.BoneMarrow Transpl.413-22(1987)。其他报道的运用此项技术的方法包括分离肿瘤细胞(参见Kemshead等，B.J.Cancer 54771-78(1986))，以及分离淋巴细胞亚群，用于随后的功能评价。用固定化抗CD3加抗CD28共刺激对CD4淋巴细胞长期增生的影响已作了报道。参见B.L.Levine等，J.Immunol.1595921-5930(1997)。在这种情本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测淋巴细胞活化的方法，其包括如下步骤：　将含有混合群的包括多数淋巴细胞亚型的细胞类型的样品与至少一种选自促细胞分裂原、抗原和共刺激物的诱导剂温育，其中各种亚型包括的淋巴细胞具有区分一种亚型与另一亚型的特征决定簇；从所述 样品中分离选择的淋巴细胞亚型；溶解所述选择亚型中的淋巴细胞以释放选自ＡＴＰ、ＮＡＤＰ和ＰＣＮＡ的胞内成分；检测所述胞内成分的水平；以及从所述检测步骤中检测的所述胞内成分的水平中对所述选择的淋巴细胞亚型的淋巴细胞活化进 行评价，其中执行所有步骤所需的总时间不超过１小时。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼德索通，理查德J科瓦尔斯基，
申请(专利权)人：西莱克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]