应用非洲淋巴细胞瘤病毒的综合抗原以检测鼻咽癌病人治疗前后的血清反应制造技术

本发明专利技术是属于使用方法的范畴，有关应用非洲淋巴细胞瘤病毒，Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（简称ＥＢ）病毒的综合抗原以检测鼻咽癌病人在治疗前后的血清反应，特别是利用ＥＢ病毒所表现的特异蛋白，如ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）、早期扩散性抗原（ＥＡ－Ｄ）、ＥＢ病毒一号核抗原（ＥＢＮＡ－１）、ＥＢ病毒特异性ＤＮＡ聚合酶（ＥＤＰ）、胸腺嘧啶激活酶（ＴＫ）及ＥＢ病毒ＢＺＬＦ－１复制激活质（ＺＥＢＲＡ）等，本发明专利技术使用ＥＢ病毒在不同感染时期所表现的特异抗原，包括潜伏感染期以及病毒复制期的六种不同抗原，以免疫分析法来检测并评估鼻咽癌病人在治疗前后，血清中对这六种不同抗原同时存在的ＩｇＡ效价情况，从而提供了一种更好的检测方法，以评估鼻咽癌病人的治疗疗效。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术是属于使用方法的范畴，有关应用非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein-Barr简称EB)病毒的综合抗原以检测鼻咽癌病人在治疗前后的血清反应。在东南亚，鼻咽癌是一种很常见的肿瘤，高发区包括中国南部、香港、台湾、新加坡，以及马来西亚，即一些较多华人或是华裔的地区。年龄调整后的年发生率约每年每十万人口三人至六十人左右。遗传倾向、饮食习惯、环境因素和病毒感染都与鼻咽癌的高发率有关。在这些因素当中，非洲淋巴细胞瘤病毒，Epstein-Barr病毒(EB病毒)，感染被认为是与疾病的发展最有关。在鼻咽癌细胞中，不仅常能检测到EB病毒的基因产物，鼻咽癌患者血清中对EB病毒抗原的IgA和IgB也都较常人高出许多。因此，EB病毒的血清研究、病毒研究、病理研究、免疫研究及分子生物研究，也最常被用来评估鼻咽癌疾病治疗前后的状况。虽然某些研究结果显示EB病毒的血清抗体效价与病人治疗预后有关，但是，不同研究结果所产生的结论并不一致。不同研究结论的产生，可能是不同的研究单位所采用的特殊EB病毒抗原，仅具有限的适用范围所致；或者是因为在癌细胞中的EB病毒并不只是潜伏性感染而已。最近，本实验室采用综合EB病毒于潜伏性感染以及急性感染期所表现的抗原，例如，EBNA-1和EA-D，以检测新鼻咽癌患者，其检测敏感性竟可达到98.1％的检测率。但上述两项抗原的结合以检测病人的血清并不能表现病人治疗的效果或病情的发展。如前所述，虽然鼻咽癌曾被认为与EB病毒的潜伏性感染有关，但是从鼻咽癌患者的血清研究所得的结果，大多数的病人具有持续性对EB病毒的高效价IgA，显示问题可能不是一般所想像的简单。对EB病毒的某特定抗原的高效价IgA，显示宿主的免疫系统是在某特定的表皮性位置上，受到此特定抗原持续性的刺激所致。还有，对EB病毒早期和晚期基因产物以及病毒囊包蛋白抗原(VCA)的高效价抗体，更显示病人的免疫系统可能最近才与这些抗原，甚至是与成熟的病毒颗粒相遇过。但是，电子显微镜的彻底研究，并无法在鼻咽癌的癌细胞中找到EB病毒病毒颗粒的存在情况。有趣的是，若是这些鼻咽癌的癌细胞曾在裸鼠中培养过，其所产生的恶性表皮细胞却可释放出EB病毒颗粒来感染狨猿的淋巴细胞。其实，新鲜培养的鼻咽癌癌细胞受到溴化去氧尿苷酸或是咐喖酯的刺激后，细胞亦可释放出EB病毒的病毒颗粒。在受丁酸钠处理过的淋巴瘤细胞，同样的现象，即EB病毒颗粒的释放也曾被观察到。这些数据显示，鼻咽癌病人的病理微环境，可调控鼻咽癌癌细胞内EB病毒的基因表现，而此种EB病毒的基因表现，则在鼻咽癌病人的IgA表现上反映出来。这种数据亦显示鼻咽癌病人对EB病毒不寻常的免疫反应，可能也是因为针对EB病毒不寻常的基因表现，或是EB病毒感染再活化的结果，或是这两种情形的混合。所以，使用病毒某感染时期的某单一抗原来研究疾病，以及预测疾病治疗的效果，应该会有其先天的限制。根据这种观念，本实验室曾使用EB病毒在不同感染时期所表现的特异抗原，包括潜伏感染期以及病毒复制期的六种不同抗原，来检测鼻咽癌病人血清中对这六种不同抗原同时存在的IgA效价情况。本实验室的研究成果，完全与以有的观察结果吻合，显示EB病毒感染在鼻咽癌癌细胞内，并不仅是潜伏性感染而已。虽然不同病人之间对不同抗原蛋白的免疫敏感性与免疫特异性都有不同的表现，但这不但表示不同抗原蛋白的免疫抗原性不同，更表示这些不同的抗原蛋白，在病人体内的表现时段长短，以及抗原蛋白表现量的多寡，呈现于病人生病期间的免疫系统的反应度而已。因此，侦测到血清中的IgA对EB病毒在不同期间所表现的基因产物，更反映出在每一个不同的病人体内其对EB病毒感染情况的免疫作用。虽然其他的说法也有其可能性，但是，这种结果与EBNA-1是维持表体EB病毒所需的事实是一致的，即EB病毒可能受到病人体内一种尚未明白的病理机制所活化。如前所述，以EBNA-1互补与EB病毒溶解周期有关的抗原，可以提供比单一抗原更好的鼻咽癌侦测法，不但其侦测率可以提高，而且能提早侦测到鼻咽癌。因此，此包括潜伏感染期以及病毒复制期所表现的整系列基因产物，作成的免疫检验试片，当然可以提供一个较精确的方法以预估病人的治疗效果，并能提早侦测到鼻咽癌的复发；此外，本实验室的实验数据不仅与其他实验室所得的实验结果非常一致，而且显示出癌细胞和病理微环境的相互作用，亦可影响EB病毒在癌细胞内的基因表现。因此，本专利技术的目的是提供一种应用非洲淋巴细胞瘤病毒的综合抗原以检测鼻咽癌病人治疗前后的血清反应的方法，进而可以提供一种更好的检测方法，以评估鼻咽癌病人的治疗疗效。本专利技术中，我们使用EB病毒在不同感染时期所表现的特异抗原，包括潜伏感染期以及病毒复制期的六种不同抗原，以免疫分析法来检测并评估鼻咽癌病人在治疗前后，血清中对这六种不同抗原同时存在的IgA效价情况。本专利技术也证实了这种方法的有效性，即本专利技术可以提供一种更好的检测方法，以评估鼻咽癌病人的治疗疗效。 附图说明图1是一个代表所有以西方墨渍法检测分析鼻咽癌病人在治疗前后血清中IgA浓度变化的反应图，每一条硝酸纤维膜上皆含有六种EB病毒的特异抗原，其个别含量如右所列EDP，0.25μg；DBP，0.25μg；TK，0.25μg；EA-D，0.25μg；EBNA-1，0.1μg；及ZEBRA，0.25μg。每一种EB病毒特异蛋白的相关位置(标示于右边)显示于S道，此S道上的EB病毒特异蛋白是以0.25％Coomasie blue染色的。箭头蛋白质分子重量标准的位置。每一条个别道的相关以酵素联结免疫吸附法所测读的A450吸收光谱值；第一道，0.598；第二道1.196；第三道，1.010(A例)；第四道，1.120；第五道，1.318；第六道，1.570(B例)；第七道，0.632；第八道，0.650；第九道，0.408；第十道，0.217(C例)；第十一道，1.212；第十二道，0.935(D例)；第十三道，1.196；和第十四道，0.461(E例)。本专利技术是属于使用方法的范畴，有关应用EB病毒的综合抗原以检测鼻咽癌病人在治疗前后的血清反应，特别是利用EB病毒所表现的特异蛋白，如DNA结合蛋白(DBP)、早期扩散性抗原(EA-D)、EB病毒一号核抗原(EBNA-1)、EB病毒特异性DNA聚合酶(EDP)、胸腺嘧啶激活酶(TK)及EB病毒BZLF-1复制激活质(ZEBRA)等。例如使用硫酸化十二脂酸钠-聚丙烯酰胺胶电泳法与西方墨渍法所得的硝酸纤维膜来检测时，每一片硝酸纤维膜细条，都包括此六种EB病毒的特异抗原；有关基因工程所产生的细菌，即利用基因工程大肠杆菌所携带的杂种载体以及杂种载体上所携带的基因，和其所制备的DNA结合蛋白、早期扩散性抗原、EB病毒一号核抗原、EB病毒特异性DNA聚合酶、胸腺嘧啶激活酶及EB病毒BZLF-1复制激活质。使用时，每个细条单独与病人的血清反应，其反应则以信号产生物连结的抗人类IgA抗体来辨识。例如以碱性磷酸酶连结的羊对人的IgA抗体及硝化四佐琳蓝和磷酸-五-溴化-四-氯化-三-吲哚辨识(Sigma，St.Louis，MO)每个硝酸纤维膜细条上的阳性反应是在特定位置上所显现的蓝紫色条纹。而本专利技术所谓的信号产生物则不限定为酵素。另固态载体检测法包括酵素联结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测鼻咽癌病人在治疗前后血清反应的方法，是使用非洲淋巴细胞瘤病毒的综合抗原作为反应因子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：周宽基，
申请(专利权)人：勤立生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]