免疫球蛋白通用文库制造技术

本发明专利技术描述了所感兴趣免疫球蛋白的文库，所述文库含有突变的所感兴趣免疫球蛋白，其中单个的预定氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的一个或多个互补决定区的一个或多个位点上被取代。所述文库含有一系列子文库，其中预定的氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的六个互补决定区（ＣＤＲ）中的每一个上以及ＣＤＲ的每一个可能的组合变体上“步移”，得到包含突变免疫球蛋白的子文库，其中所述突变免疫球蛋白在每个ＣＤＲ的一个或多个位点上具有预定的氨基酸，总体来说在每一个ＣＤＲ的每一个位点上都具有预定的氨基酸。本发明专利技术进一步包括通用文库，所述通用文库中对于作为单个的预定氨基酸的每一个天然存在的氨基酸都含有一个这样的文库，一共是二十个文库；而且还包括编码所述文库的核苷酸文库。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请本申请要求保护2002年4月17日申请的美国临时申请No.60/373,558的权利。在此引入上述申请的全文作为参考。
技术介绍
在蛋白质和功能研究中诱发突变是一种强有力的工具。可以在编码所感兴趣蛋白质的克隆基因的核苷酸序列中进行突变，所修饰的基因可以进行表达以产生蛋白质突变体。将野生型蛋白和所产生的突变体蛋白的性质进行比较，就有可能识别出对于蛋白的结构完整性和/或生化功能，例如其结合和/或催化活性所必须的单个氨基酸或氨基酸域。可以用一个蛋白产生多个突变体，但是要选择能提供信息的或具有所希望性质的突变体是很困难的，即使所选择的突变体包含的突变完全是在推定的蛋白的重要区域(例如在蛋白活性位点或其周围的区域)。例如，特定氨基酸的取代，缺失或插入都可以对蛋白质造成局部的或整体的影响。目前仍然需要能够系统评价蛋白突变效果的方法。专利技术简述本专利技术涉及所感兴趣免疫球蛋白的文库。所述的文库建立在所感兴趣的原型球蛋白的基础上，可以通过对原型球蛋白进行步移法突变获得。在一个实施方案中，本专利技术的单个预定氨基酸文库包括突变的所感兴趣免疫球蛋白，其中单个预定氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的一个或多个互补决定区的一个或多个位点处被取代；所述文库包含一系列子文库，包括a)一个含有所感兴趣原型免疫球蛋白的子文库；b)六个含有突变免疫球蛋白的子文库(所感兴趣免疫球蛋白的六个互补决定区中的每一个都有一个子文库)，其中预定氨基酸只在该免疫球蛋白的六个互补决定区其中一个的一个或多个位点被取代；c)15个含有突变免疫球蛋白的子文库(每种可能的六个互补决定区之中的两个的组合都有一个子文库)，其中预定氨基酸在六个互补决定区其中两个的一个或多个位点被取代；d)20个含有突变免疫球蛋白的子文库(每种可能的六个互补决定区之中的三个的组合都有一个子文库)，其中预定氨基酸在六个互补决定区其中三个的一个或多个位点被取代；e)15个含有突变免疫球蛋白的子文库(每种可能的六个互补决定区之中的四个的组合都有一个子文库)，其中预定氨基酸在六个互补决定区其中的四个的一个或多个位点被取代；f)六个含有突变免疫球蛋白的子文库(每种可能的六个互补决定区之中的五个的组合都有一个子文库)，其中预定氨基酸在六个互补决定区其中五个的一个或多个位点被取代；以及g)一个含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在全部六个互补决定区中的一个或多个位点被取代。每个含有突变免疫球蛋白的子文库都含有其中预定氨基酸在所述预定氨基酸被引入的互补决定区的每个位点上出现至少一次的突变免疫球蛋白。预定氨基酸选自于20个天然存在的氨基酸。所感兴趣免疫球蛋白可以是整个免疫球蛋白，或者是免疫球蛋白的一个Fab片断，或者是免疫球蛋白的一条链。所感兴趣免疫球蛋白可以是免疫球蛋白的五种类型(IgG，IgM，IgA，IgD或IgE)中的任何一种。在一个实施方案中，所感兴趣的免疫球蛋白是催化性抗体。本专利技术进一步涉及所感兴趣原型免疫球蛋白的通用文库，其中该通用文库包括20个上述的“单个预定氨基酸”文库，20个天然存在的核苷酸中每一个都具有一个文库。本专利技术还涉及编码此单个预定氨基酸文库的核苷酸文库，以及编码通用文库的核苷酸文库。这里所说的文库含有容易识别的突变免疫球蛋白，使得可以对所感兴趣原型免疫球蛋白的结合区域，以及每个特定的预定氨基酸在结合区域活性中所起的作用进行系统分析。所述文库可以为能改变所感兴趣免疫球蛋白与其抗原的相互作用的特定突变提供特定的信息，其中所述的相互作用包括在不同的互补决定区的氨基酸之间的多种相互作用，同时所述文库可避免与分析任意突变所产生的突变体相关的问题。附图简述附图说明图1A-1B显示了GP-120单链FV的全序列，包括核苷酸序列(SEQ ID NO1)和编码的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。图2显示了图1A-1B所示的GP-120 scFV基因的总体装配示意图。图3总结了通过本专利技术的方法得到的scFV基因文库，以及每个单独的文库产生的基因变体数目。图4是图2所示的装配示意图中所使用的寡核苷酸集合。图5A-5B是以多种不同的组合在Fv的单个CDR中引入三个(3)靶核苷酸，Ser，His和Asp所用的寡核苷酸集合。集合序列用IUPAC混合碱基命名法给出，以大写字母表示，R＝A或者G，Y＝C或者T，M＝A或者C，K＝G或者T，S＝C或者G，W＝A或者T；H＝A或者C或者T，B＝C或者G或者T，V＝A或者C或者G，D＝A或者G或者T。图6是生成GP-120 scFV文库所进行的VL和VH基因装配策略，其中六个CDR区域中的三个(3)同时进行突变以以多种(8)不同的组合(L1到L8)生成选定的氨基酸(Ser，His和Asp)。图7A-7B是第一个VL区域(6个CDR区域中的第一个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。图8A-8B是第二个VL区域(6个CDR区域中的第二个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。图9A-9B是第三个VL区域(6个CDR区域中的第三个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。图10A-10B是第一个VH区域(6个CDR区域中的第四个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。图11A-11B是第二个VH区域(6个CDR区域中的第五个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。图12A-12B是第三个VH区域(6个CDR区域中的第六个)的20个单个寡核苷酸库，每一个库都相应于20个天然氨基酸中的一个。图13A-13D是单个氨基酸的CDR库的分组。专利技术详述本专利技术涉及所感兴趣免疫球蛋白的文库，包括含有编码免疫球蛋白的核苷酸的文库，以及含有免疫球蛋白自身的文库。这里所说的“免疫球蛋白”是一种抗体蛋白，可以应答并结合特定的抗原。已知有五种，或者五类免疫球蛋白IgG，IgM，IgA，IgD和IgE(参见，例如，Dictionary of Cell and Molecular Biology，ThirdEdition)。免疫球蛋白的基本形式是IgG形式它包括两个相同的重链(H)和两个相同的轻链(L)，通过二硫键以“Y”的形状连接起来。重链包含四个区，包括三个恒定区(CH)和一个可变区(VH)。轻链具有一个恒定区(CL)和一个可变区(VL)。每个重链可变区和每个轻链可变区都含有三个高度可变的环，也叫作互补决定区(CDR)。抗原结合位点(Fv)区(也称为“结合袋(binding pocket)”)包括这样的六个高度可变(CDR)环(三个在免疫球蛋白重链可变区(VH)，三个在轻链可变区(VL))。每个免疫球蛋白分子的CDR的残基与其它免疫球蛋白分子都不同，这使的抗原对于每个抗体都是特异的。下面对每种免疫球蛋白进行简单描述。免疫球蛋白G(IgG)IgG是一类经典的免疫球蛋白；IgG的分子量大约是150kD。如上所述，IgG由两个相同的轻链和两个相同的重链组成。IgG分子可以被蛋白水解为两个Fab片段和一个Fc片段。Fab包括抗原结合位点(轻链和重链的可变区)，轻链的恒定区，重链的三个恒定区中的一个。Fc区域由其余的重链的固定区组成；它含有细胞结合位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种所感兴趣的原型免疫球蛋白文库，包括突变的所感兴趣免疫球蛋白，其中单个预定氨基酸在所感兴趣免疫球蛋白的一个或多个互补决定区的一个或多个位点被取代，所述文库包括子文库，所述文库包括：ａ）含有所感兴趣原型球蛋白的子文库，ｂ）含 有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中一个的一个或多个位点处被取代，六个互补决定区中的每个都有一个子文库，因而总共有６个子文库；ｃ）含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六 个互补决定区其中两个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的两个的组合都有一个子文库，因而总共有１５个子文库；ｄ）含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中三个的一个或多个位点处被取 代，每种可能的六个互补决定区中的三个的组合都有一个子文库，因而总共有２０个子文库；ｅ）含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中四个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的四个的组合 都有一个子文库，因而总共有１５个子文库；ｆ）含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的六个互补决定区其中五个的一个或多个位点处被取代，每种可能的六个互补决定区中的五个的组合都有一个子文库，因而总共有６个子文库； ｇ）含有突变免疫球蛋白的子文库，其中预定氨基酸在所述免疫球蛋白的全部六个互补决定区的一个或多个位点处被取代，其中每个含有突变免疫球蛋白的子文库，都含有其中预定氨基酸在所述预定氨基酸被引入的互补决定区的每个位点都存在至少一次的突变 免疫球蛋白。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特欧克瑞，
申请(专利权)人：罗伯特欧克瑞，
类型：发明
国别省市：US[美国]