用于分析蛋白的方法和组合物技术

本发明专利技术公开了在标本中检测一种或多种靶多肽的方法、组合物和试剂盒，其中靶多肽已经接受了翻译后修饰。含标本的混合物和含致裂解部分的第一个试剂及针对靶多肽上结合部位的第一个结合剂被置于各自结合部分发生结合的条件下。结合部位是靶多肽参与的翻译后修饰活动的结果。本方法可用于检测靶多肽本身。在另一个实施例中，靶多肽的存在和／或量与一个物质的存在和／或量和／或活性有关，如参与靶多肽翻译后修饰的酶。第一个结合剂和结合部位间的相互作用将致裂解部分带到可裂解部分的近旁，可裂解部分与多肽相连且仅当与致裂解部分接近时容易被裂解。以此方式，每个多肽的电泳标记可被释放。释放的电泳标记被分离，并根据相应的电泳标记检测靶多肽的存在和／或量。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本专利技术涉及用于检测和可定量多肽的可分离组合物、方法和试剂盒。专利技术发现了在多肽多重检测领域的特殊应用，多肽包括参与翻译后活动的蛋白。在许多医学学科中，在血液或其它生物学液体中检测许多被分析物的需要已变得日益明显，包括多肽和核酸序列。大多数多分析物检测，如在基因组范围内检测多个核酸序列的测定，涉及多个步骤，具有很少的灵敏性，有限的动力学范围(通常相当于2至100倍差异)，有些需要复杂的仪器。多分析物检测的一些已知的经典方法包括如下a.应用两个不同的放射性同位素标记来区分两个不同的被分析物。b.应用两个或以上不同的荧光标记来区分两个或以上被分析物。c.应用无机螯合物，其寿命和波长都被用于区分两个或以上被分析物。d.应用荧光和化学发光标记来区分两个或以上被分析物。e.应用两个不同的酶来区分两个或以上被分析物。f.应用酶和吖啶酯类来区分两个或以上被分析物。g.不同被分析物的空间分辨率，例如排列，来鉴定和量化多个被分析物。h.应用吖啶酯类标记，其寿命或dioxetanone的形成被用来量化两个不同的病毒靶。蛋白组在过去的几年已经引起人们的兴趣。由于蛋白组比基因组更复杂，蛋白研究比mRNA研究提供了更精确的细胞生物学图谱。蛋白组领域是非常广的，涉及的领域如，例如，通过应用二维凝胶电泳和质谱分析的蛋白构型来研究蛋白在细胞中的表达，用酵母双杂交方法研究蛋白-蛋白相互作用，通路分析以了解信号传导和其它复杂的细胞过程，大规模蛋白折叠和3-D结构研究以及蛋白的高通量表达和纯化，在代谢、有丝分裂、减数分裂过程中应答外部刺激的细胞表达，如药物、病毒、物理或化学条件的改变，包括营养素和辅因子的过剩或不足，应激，衰老，存在特殊的生物体菌株并鉴定生物体和菌株，多药耐药，蛋白-DNA相互作用，蛋白-肽相互作用，等。有必要有一种方法在单一标本中鉴定多数蛋白以及对被检测的不同蛋白提供一些定量分析。随着人类基因组被阐明，会有大量的机会进行涉及基因编码序列的诊断程序。基因的一个主要功能是产生蛋白，它在细胞中完成的工作中起重要的作用。由于细胞中的蛋白功能是动态的，特定蛋白在特定时间点的结构、浓度、位置等等是不断变化的。蛋白表达方式的分析是正在进行的基因组计划的目的。对蛋白生理学活性形式及其在细胞中空间和时间相互作用的研究是整体研究的重要方面。蛋白的一个翻译后修饰是添加或去除磷酸盐基团。蛋白磷酸化作用和去磷酸化作用反应已被确定是代谢调节和信号传导通路的主要组成部分。蛋白磷酸化作用的变化提供了目前已知的生物学系统中主要的酶调节方法，特别是在细胞表面受体的信号传导的调节中。可逆的磷酸化作用对于传导调节信号是重要的，包括所有活细胞中的增殖调节信号。为理解这些调节机制的分子基础，有必要鉴定被磷酸化的特异氨基酸残基。通过鉴定磷酸化作用的底物和位点，可开发对某些肿瘤的诊断工具，且磷酸化过程本身的修饰可能成为治疗干预的靶标。多肽如生长因子、分化因子和激素对协调多细胞生物体发育的调节系统是至关重要的成分。许多这些因子通过结合到并活化具有内在蛋白酪氨酸激酶活性的细胞表面受体来介导其多效性作用。由细胞外信号传导分子如生长因子和细胞因子引起的细胞行为改变需要完成转录活动的复杂程序。为激活或抑制转录，转录因子必须位于核内，与DNA结合，并与基本转录结构相互作用。因此，调节转录因子活性的细胞外信号可影响这些过程的一种或多种。最普通地，通过可逆的磷酸化作用获得调节。由几种不同激酶(或通过与一个以上通路相联系的激酶)引起的转录因子的磷酸化作用是简单的机制，使不同的信号集中于相同的因子。文献中有许多方法关注于磷酸化作用的分析。一个这种方法是32P-标记蛋白的二维磷酸肽图谱。另一个方法依赖于分析非放射标记磷酸蛋白的质谱分析。在另一个方法中(Cao，等人，Rapid Commun.Mass Spectrom.(2000)5141600-1606)，用即时的固定金属亲合层析(IMAC)/毛细管电泳(CE)/电喷离子化多相序贯质谱分析(MS)绘制蛋白的磷酸化作用位点图谱。IMAC树脂保留和预浓缩磷酸化的蛋白和肽，CE从IMAC树脂上洗脱出来的混合物中分离磷酸肽，MS提供了包括每个成分磷酸化作用位点的信息。磷酸化肽微量纯化的步骤，作为质谱分析的馏分前端，由Posewitz，等人公开，Anal.Chem.(1999)712883-2892。使用微量吸头形式的固定金属亲合层析，更特别地与镓III离子联合使用。磷酸肽以接近定量和高度选择性的方式被回收，以产生浓缩的标本，直接通过矩阵辅助激光解吸附/飞行电离时间和毫微电喷电离质谱分析而分析。但是，仍然需要鉴定和/或检测多肽的活性和/或检测多肽存在和/或量的方法，多肽参与了翻译后修饰过程。该方法应当能够识别已经发生的修饰，修饰的单个或多个位点以及修饰位点的位置。该方法应当应用类别特异的试剂，可能并能够在单一测定中检测多个多肽，即，具有高度的多重技术能力。该方法应当能够实时地提供要检测的信息，并能够确定某种多肽在生物学通路中的重要性。此外，无论特定通路是否被激活，为了检测，该方法使用多重技术是很重要的。专利技术概述在一个方面，本专利技术关注于在怀疑含有靶多肽的标本中检测一种或多种靶多肽的存在和/或量的方法。形成的混合物含有(i)标本；(ii)包括致裂解部分的第一个试剂(这里也指″类别特异的试剂″)和对一种或多种靶多肽上的翻译后修饰特异的第一个结合剂；和(iii)一种或多种电泳探针和一种或多种电泳标记，每个探针具有对靶多肽特异的结合部分，每个标记上附有可裂解的连接。混合物被置于每个结合剂与每个部分发生结合的条件下。第一个结合剂和翻译后修饰间的相互作用将致裂解部分带到可裂解连接的近旁(这里也称作″有效近端″)，可裂解连接在与多肽相连的探针上，且仅当与致裂解部分接近时才容易被裂解。以此方式，只有当结合发生时，每个多肽的独特电泳标记可从电泳探针上释放。然后释放的电泳标记被分离，并根据相应标记的特性和量检测靶多肽的存在和/或量。优选地，每个电泳标记具有独特的光学和/或电荷-质量特征。本专利技术的另一个实施例是在一个标本中进行多重测定以检测多数靶多肽的方法，其中的靶多肽已经接受了磷酸化作用。标本与包含致裂解部分的第一个试剂、含有亲合性支持物的第一个结合剂和多数电泳探针结合。每个电泳探针含有各自靶多肽的结合部分和可裂解或可释放的电泳标记。结合体接受使第一个结合剂与靶多肽结合的条件。每个电泳探针中的电泳标记包括i)只有当与致裂解部分接近时才容易被裂解的可裂解连接，和ii)具有独特的电泳和/或光学特性的可检测部分。第一个结合剂和靶多肽间的相互作用将致裂解部分带到可裂解连接的近旁。通过裂解可裂解连接，电泳标记从与靶多肽连接的电泳探针上释放。释放的标记通过每个标记特有的分离和光学特征而被鉴定，并检测标本中靶多肽的存在。优选地，电泳标记具有独特的电泳迁移率和/或荧光特征。本专利技术的另一个实施例是用于检测多数靶多肽的每一个和任一个的存在和/或量和/或活性的组合物，靶多肽属于预先确定的一类翻译后物质如磷酸化的蛋白、糖蛋白、脂质衍生的蛋白，等。组合物包括含有致裂解部分的第一个试剂和结合部位的第一个结合剂，结合部位含有靶多肽的翻译后修饰。检测可以是对靶多肽本身或对参与靶多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
在怀疑含有靶多肽的标本中检测一种或多种靶多肽存在或不存在的方法，该方法包括以下步骤：　提供种类特异的试剂和一种或多种电泳探针，种类特异的试剂具有有效接近范围的致裂解部分和对一种或多种靶多肽的翻译后修饰特异的第一种结合剂，每一种具有对 靶多肽特异的结合部分的一种或多种电泳探针和每一个上附着在其上的通过可裂解连接的一种或多种电泳标记；混合标本、种类特异的试剂和一种或多种电泳探针，使种类特异的试剂和一种或多种电泳探针结合到一种或多种靶多肽上，且一种或多种电泳探针中的至 少一个可裂解连接在有效接近致裂解部分的范围内，使得一种或多种电泳标记被释放；电泳分离释放的电泳标记；和根据存在或不存在释放的电泳标记检测存在或不存在一种或多种靶多肽。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S辛格，H萨利米穆萨威，SH塔稀尔，GJ沃韦伯，VS埃尔南德斯，TJ马特雷，H基拉科相，
申请(专利权)人：埃克来拉生物科学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]