本发明专利技术涉及一种表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞、分离该细胞的方法，以及该细胞的用途。本发明专利技术所述的方法包括：提供一种以C57BL/6为遗传背景的巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型；饲养小鼠至1周龄或以上，分离肾，用胶原酶IV和胰蛋白酶消化，过滤消化后的细胞悬液，筛除肾结缔组织、肾小管和细胞团块，获得单个细胞；通过流式细胞仪进行分选，收集表达绿色荧光蛋白的荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞。本发明专利技术提供了根据上述方法分离的肾源干/祖细胞，以及进一步在培养基中培养获得的自我更新和增殖的细胞，并且提供了将这些细胞用于制备治疗肾损伤修复的组合物的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞与组织工程领域，涉及一种表达巢蛋白(Nestin)的肾源干细胞或祖细胞(Nestin+RSPCs)、分离该肾源干/祖细胞的方法，以及该肾源干/祖细胞的用途。本专利技术特别涉及巢蛋白-绿色突光蛋白(Nestin-Green Fluorescent Protein,Nestin-GPF)转基因小鼠通过流式分选技术分离Nestin+肾源干/祖细胞(Nestin+RSPCs)，并验证其自我更新能力和增殖能力；随后细胞移植到肾缺血损伤动物模型体内，鉴定Nestin+RSPCs在体内的分化特性和损伤修复的功能。
技术介绍
肾源干细胞的研究起步较晚，对其生物学特性的认识有很大局限性。近几年研究报道了成体肾组织分离具有干/祖细胞潜能细胞的方法，但大多数属于回顾性研究，分离得到的细胞很难鉴定是否真正的干细胞。有研究报道发现肾小管(tubules)和肾乳头间质(interstitium of renalpapilla)中的一些低更新率(slow-cycling)的细胞,存在某些干/祖细胞特性(Hong KU,Reynolds SDj Giangreco A, et al. Clara cell secretory protein-expressing cellsof the airway neuroepithelial body microenvironment include a label-retainingsubset and are critical for epithelial renewal after progenitor cell depletion.Am J Respir Cell Mol Biol. 2001. 24: 671-681 )，但后来被证实它们只是具有某些干/ 袓细胞特性的已分化的细胞(Maeshima A, Yamashita S，Nojima Y. Identificationof renal progenitor-like tubular cells that participate in the regenerationprocesses of the kidney. J Am Soc Nephrol. 2003. 14: 3138-3146)。该类细胞与肾其它不同更新速率细胞的分化程度没有区别(Bruno S，Bussolati B，Grange C，et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells inhuman glomeruli. Stem Cells Dev. 2009. 18: 867-880)，并且成体分化了的上皮细胞(epithelial cell)也有形成克隆和自我更新的能力(Cicero SAj Johnson D，ReyntjensS， et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmentedciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106:6685-6690)。 ImaiN等在特定培养条件下获的类似干细胞的细胞，但该细胞却不能修复缺血再灌注损伤的肾组织(Imai N，Hishikawa K，Marumo Tj et al. Inhibition of histone deacetylaseactivates side population cells in kidney and partially reverses chronic renalinjury. Stem Cells. 2007. 25: 2469-2475)。Thiery JP 等研究提不，Imai N 等得到的细胞可能是由于体外培养导致上皮细胞产生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransitions, EMT)而产生的，这种状态下的细胞表现出某些袓细胞样的特性，但不产生相应的袓细胞功能(Thiery JPj Acloque H，Huang RYj et al. Epithelial-mesenchymaltransitions in development and disease. Cell. 2009.139: 871-890)。有研究人员利用⑶133、⑶24、干细胞抗原-I (Sca-I)和受体酪氨酸蛋白激酶等表面标志物，在肾间质(interstitium)和肾小球囊的泌尿极中分离鉴定干细胞(Lazzeri Ej CrescioliC， Ronconi E, et al. Regenerative potential of embryonic renal multipotentprogenitors in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2007. 18: 3128-3138)。但进一步研究发现，这些表面标志物在分化的上皮细胞中均有很高的表达。因而，利用这些非特异性的表面标志物得到的细胞，很难区分是真正的干细胞，还是有某些祖细胞特性的上皮细胞，或者是间质/基质细胞(mesenchymal stromal cell)。因而，利用特异表面标志是寻找分离肾源干细胞的最有效方法。Dekel B等比较人胚胎肾细胞和小儿肾恶性Wilms’瘤的表达谱，鉴定的胚胎肾源干细胞表面标志基因包括神经细胞粘附分子I (neural cell adhesion molecule I, NCAM1, CD56),聚唾液酸神经细胞粘附分子 I (poly-sialated neural cell adhesion molecule 1PSA-NCAM1)，FZD7, FZD2, DLKl, ACVRIIB 和 NTRK2 (Dekel B, Metsuyanim S, Schmidt-Ott KM, etal. Multiple imprinted and sternness genes provide a link between normal andtumor progenitor cells of the developing human kidney. Cancer Res. 2006. 66:6040-6049)。Metsuyanim S等根据Dekel B等的研究结果,利用NCAMl成功定位并分离了人胚胎的肾干细胞(Metsuyanim S，Harari-Steinberg O, Buzhor E, et al. Expressionof stem cell markers in the human fetal kidney. Plos One. 2009. 4: e6709)o 然而，由于本专利技术人对成体肾源干细胞生物学特性以及基因表达特点认识的匮乏，迄今仍无法利用特异表面标志物对其进行直接高效的分离。这也限制了成体肾源干细胞在肾疾病治疗研究的开展。巢蛋白(Nestin)作为中间丝蛋白家族成员之一，在胚胎发育过程中广泛表达，最早的表达时间出现在胚胎发育本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离肾源干细胞或祖细胞的方法，其中所述细胞表达巢蛋白，所述方法包括：提供一种以C57BL/6为遗传背景的巢蛋白？绿色荧光蛋白转基因小鼠模型；饲养所述转基因小鼠模型的小鼠至1周龄或以上，分离小鼠肾，用胶原酶IV和胰蛋白酶消化，过滤消化后的细胞悬液，筛除肾结缔组织、肾小管和细胞团块，获得单个细胞，所述细胞产生受巢蛋白增强子控制的增强型绿色荧光蛋白；将上述单个细胞通过流式细胞仪进行分选，用C57B/6小鼠细胞做阴性对照细胞，收集表达绿色荧光蛋白的荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：项鹏，姜美花，
申请(专利权)人：广东江源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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