本发明专利技术目的在于提供一种试剂盒及其应用；本发明专利技术的另一个目的还在于提供有效稳定的获得外周血MSC的方法。本发明专利技术采用GCSF联合AMD100成功动员外周血并分离培养出成纤维细胞样贴壁细胞，通过形态学、贴壁能力、表面标记和三系分化鉴定分离的细胞为MSC，并与同一动物骨髓来源MSC的生物学特性比较发现：外周血和骨髓来源的MSC具有相同的形态学特征和贴壁生长能力、表面标记、抗凋亡和衰老的特性；均具备自我更新和三系分化潜能，但骨髓MSC的增殖潜能和成骨能力强于外周血MSC，而成脂和成软骨分化能力弱于外周血MSC。再者，PB-MSC用于治疗关节软骨缺损取得较好的修复效果。因此，动员外周血来源的MSC基本具备骨髓MSC相似的生物学特性，其作为一种可供选择的MSC来源用于细胞治疗和再生医学领域具有非常广阔的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及再生医学领域，特别涉及具有极大临床应用前景的外周血来源MSC的动员采集培养、生物学特性及应用。
技术介绍
因损伤、感染等导致的组织器官的修复重建一直是临床细胞治疗和再生医学领域的研究重点和难题。虽然异体移植的基础和临床研究取得了很大的进展，但是自体移植修复重建自体组织器官一直是治疗的金标准。近年来中胚层来源的成体干细胞间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)因其自我更新、多向分化潜能和免疫调控及不存在伦理道德的争议成为目前细胞治疗和组织工程种子细胞的研究热点。在适当的诱导条件下，MSC在体内外能分化成骨、软骨、脂肪细胞、纤维组织和支持造血组织、甚至内胚层和外胚层来源的任一组织，移植后能修复重建骨、软骨、肌肉、肌腱韧带、脑、脊髓、肺、心血管、肝、皮肤、胃肠道和造血系统，当其注射到早期囊胚泡时能形成大多数成体细胞类型。传统的MSC主要来源于骨髓(Bone Marrow，BM)，但是其应用于临床最大的瓶颈是取材的创伤和并发症、非常有限的数目(O. 01% O. 001%)及其体外培养生物学特性的改变和转化。因此开发其它来源的MSC非常紧迫。除骨髓外，MSC还广泛分布于间充质组织(如骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、脂肪)、骨膜、滑膜、滑液、皮肤、外周血、心血管、肝、胰腺、神经系统、肾、肺、脐(带)血、胎盘、羊水、胚胎甚至胎儿组织。近年来动员外周血(Peripheral Blood, PB)来源的MSC因其取材微创甚至无创，可以实现真正的自体移植具有非常广阔的临床应用前景。但其进入实验研究和临床应用的瓶颈是有效的动员方法、动员后MSCs的有限数量和生物学特性容易发生改变。在正常生理成年或非动员的情况下外周血中很难分离得到贴壁的MSC，有作者报道即使采用常用动员药物粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor, GCSF)动员后在外周血中也只能分离极少量的MSC，且在体外分离培养20 25天后就出现衰老，增殖能力非常有限，表现为检测不到端粒酶的活性且端粒酶显著变短。研究证据表明在某些病理状况下从骨髓或其他组织释放MSC归巢到损伤组织参与其修复，此时在外周血中可以分离得到MSC。骨髓中含有3种细胞造血干细胞(HSC)、内皮祖细胞(EPC)和MSC，干细胞贮留在骨髓微环境是因为CXCR4和附近支持细胞释放的SDF-I的相互作用。目前常用的骨髓动员药物是GCSF，其作用机制是通过减少受体和配子的表达来破坏SDF-1/CXCR4轴动员HSC释放进入循环中。最近的研究表明采用GCSF联合CXCR4 (chemokine (C-X-C motif)receptor 4)拮抗剂 AMD3100 (又名 Plerixafor)可以导致HSC10倍甚至更多的释放。在动员HSC的同时是否能刺激MSC的动员呢？目前的问题是MSC的有效的动员及采集方法，再者获得的细胞是否具备骨髓MSC同样的生物学特性及体内修复组织缺损的效果目前仍不清楚。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种试剂盒及其应用；本专利技术的另一个目的还在于提供有效稳定的获得外周血MSC的方法。本专利技术是通过如下技术方案实现的一种试剂盒每一个试剂盒中G-CSF (O. 6ml: IOOug/支)与CXCR4拮抗剂AMD3100(5mg/支)。所述试剂盒在有效稳定的获得外周血MSC的制剂中的应用。一种有效稳定的获得外周血MSC的方法，包括如下步骤I)、采用G-CSF结合AMD3100联合动员骨髓MSC释放入血连续5天皮下注射GCSF (50 μ g/kg i. h),第 6 天皮下注射 AMD3100 (5mg/kg i. h), Ih 后无菌条件下米血 IOml注入含300U/ml管中。2)、外周血MSC的分离培养扩增抽取血标本与红细胞裂解液(O. 154M氯化铵，IOmM碳酸氢钾，O. ImM乙二胺四乙 酸)按体积比I : 10的比例混合，常温裂解lOmin，经离心、PBS洗后，以106/ml密度重悬于完全培养基中(0|^，10%胎牛血清，10(^/!111青霉素，100μ g/ml链霉素，25ng/ml两性霉素B，2m M L-谷氨酰胺)，置于37°、5%C02培养箱中。3 4天后去除不贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，10 15天后细胞达到80% 90%融合，用0. 25%胰酶/0. IEDTA消化，按I : 3或I : 4传代，体外培养扩增至P3，得到均一的MSC。另一方面，本专利技术还提供上述动员培养的外周血MSC与同一动物个体来源的骨髓MSC的生物学特性比较。此外本专利技术还提供上述动员培养的外周血MSC用于修复关节软骨缺损的实例说明其可应用于组织器官病损修复重建中的用途。附图说明图I :外周血和骨髓来源MSC的形态学观察(相差倒置显微镜)图2 :流式细胞仪鉴定外周血和骨髓来源MSC表面标记图3 :外周血和骨髓来源MSC的三系分化潜能比较(成骨、成脂、成软骨)图4 :外周血和骨髓来源MSC的增殖潜能比较图5 :外周血和骨髓来源MSC抗凋亡能力比较图6 :外周血和骨髓来源MSC体外培养细胞衰老比较图7 =PB-MSC体内修复兔关节软骨缺损的效果比较本专利技术采用GCSF联合AMD100成功动员外周血并分离培养出成纤维细胞样贴壁细胞，通过形态学、贴壁能力、表面标记和三系分化鉴定分离的细胞为MSC，并与同一动物骨髓来源MSC的生物学特性比较发现外周血和骨髓来源的MSC具有相同的形态学特征和贴壁生长能力、表面标记、抗凋亡和衰老的特性；均具备自我更新和三系分化潜能，但骨髓MSC的增殖潜能和成骨能力强于外周血MSC，而成脂和成软骨分化能力弱于外周血MSC。再者，PB-MSC用于治疗关节软骨缺损取得较好的修复效果。因此，动员外周血来源的MSC基本具备骨髓MSC相似的生物学特性，其作为一种可供选择的MSC来源用于细胞治疗和再生医学领域具有非常广阔的临床应用前景。实验例I :兔外周血MSC的动员、分离培养及与骨髓MSC的体外生物学特性比较实验动物3月龄新西兰兔，体重± 2kg，雌雄不限。连续5 天皮下注射 GCSF (50 μ g/kg i. h),第 6 天皮下注射 AMD3100 (5mg/kg i. h),Ih后无菌条件下经耳中央动脉采血IOml注入含300U/ml管中。外周血、骨髓MSC的分离、培养扩增抽取的血标本与红细胞裂解液(O. 154M氯化铵，IOmM碳酸氢钾，O. ImM乙二胺四乙酸)按I : 10比例混合常温裂解lOmin，经离心、PBS洗后，以106/ml密度重悬于完全培养基中(a MEM, 10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100 μ g/1111链霉素，25叩/1111两性霉素^2111 M L-谷氨酰胺)，至于37° 5% CO2培养箱中。3 4天后去除不贴壁细胞，以后每4天换液一次。10 15天后细胞达到80% 90%融合,用O.25%胰酶/0. 1% EDTA消化传代，体外培养扩增至第三代(P3)。麻醉下抽吸同一动物股骨和胫骨骨髓(4ml)，l IPBS稀释后置于等体积的Ficoll淋巴分离液上，经密度梯度离心，PBS洗后以106/ml密度重悬于完全培养基中接种，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种试剂盒，其特征在于一个试剂盒中包含G？CSF和CXCR4拮抗剂AMD3100，G？CSF含量为100ug/支，CXCR4拮抗剂AMD3100含量为5mg/支。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付维力，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：
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