一种间充质干细胞无血清培养基制造技术

本发明专利技术涉及生物领域，公开了一种无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、Hepes、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人白蛋白、2-巯基乙醇、原儿茶酸、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、氢化可的松、维生素C、粘接胺或重组人纤连蛋白、黄体酮、腐胺、肝素、血清素、EGF、b-FGF、PDGF-BB、IGF-I。本发明专利技术所述无血清培养基化学成分明确、无动物源、无血清，培养细胞安全、理想，避免了掺杂动物成分和批次的不稳定性，培养间充质干细胞结果显示其细胞总数、细胞表型和分泌细胞因子均正常，具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域，特别涉及ー种间充质干细胞无血清培养基。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是属于中胚层的ー类多能干细胞，具有強大的増殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、造血细胞、神经细胞、胰岛细胞等多种细胞的能力。MSC来源广泛，易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，无道德伦理问题的限制、所以在组织工程、基因治疗和免疫治疗方面有着巨大的应用前景。MSC在组织中的比例极低，通过体外分离获取的MSC数量非常有限，远远无法满足 临床和研究的需求。非分化性増殖，即在保持MSC的多向分化潜能和未分化状态的同时又能快速有效地増殖，成了目前急需解决的问题。目前国内外实验室和临床研究的EPC的扩增体系，主要是基础培养基添加一定浓度的胎牛血清(FBS)。FBS中含有异种蛋白质，它本身有携帯细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明MSC在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注干细胞治疗后治疗失效。因此FBS在干细胞临床大規模培养中的不利因素已经逐渐暴露出来，现已有很多学者研究FBS的替代品。一些临床研究使用商用血清替代物UltroserG(PalI BioSepra)，这种培养基含有多种生长因子、结合蛋白、维生素和激素，能较好地满足MSC生长的需要，然而Ultroser G仍然还有一些动物源成分。目前人们使用较多的是应用人血清或血清衍生物来替代。包括成人血清、血小板衍生物(血小板裂解液、凝血酶激活血小板释放因子)、脐血清等。这些成份虽然来源于人，输注人体内不会引起异种蛋白的免疫，但这些人源成分化学成分不明确，不利于进行MSC的深入研究，而且这些成分会将ー些人源的ー些潜在带入细胞。更关键在于目前人血清、血小板资源少，无法保证MSC的大規模培养。当前也有ー些公司开发的新一代无血清培养基.如Invitrogen开发StcniProlOMSC SFM XenoFree无血清培养基、加拿大 stemcell 公司开发了 MesenCultTM-XF Medium无血清培养基、BD公司开发的BDMOSAICTM Hmsc SF Medium和CellGenix开发的CdlGro Serum-free MSC Medium等。但这些培养基价格昂贵，在培养MSC过程中都需要使用附属产品进行细胞培养瓶的包被处理，且有可能在明胶包被的过程中引入动物源成分，而且这也増加了工作量和污染的机会，而且ー些研究者在使用这些产品时发现并不支持MSC的原代培养或者在原代培养的过程中需要添加2%血清(Hudson JE, Mills RJ, Frith JE, etal. A defined medium and suostrate for expansion oi human mesenchymal stroma丄cell progenitors that enriches for osteo—and chondrogenic precursors. Stem CellsDev. 2011;20:77-87.)。而且这些产品在使用过程中需要有高的细胞接种密度要求，在低密度细胞接种时这些培养基无法使用(见表I)。表I市场上的MSC无血清培养基权利要求1.一种无血清培养基，其必要组分为MDM 17. 7g/L、L-谷氨酰胺l_5mM、碳酸氢钠3.024g/L、Hepes l_5mM、重组人胰岛素Ι-lOmg/L、重组人转铁蛋白5_20mg/L、重组人白蛋白4-10g/L、2-巯基乙醇55nM、原儿茶酸l_5mmol/L、脂质O. Ι-lmg/L、氨基酸Ι-lOg/L、维生素 Ι-lOmg/L、微量元素 l-5mg/L、H100_500mg/L、氢化可的松 l_50ng/ml、维生素C l_50mg/L、粘接胺或重组人纤连蛋白l_5mg/L、黄体酮10_20ng/ml、腐胺l-10mg/L、肝素 1-lOIU/mL、血清素 l-5mg/L、EGF l-10ng/ml、b_FGF l-10ng/ml,PDGF-BB 1-lOng/ml、IGF-I l-10ng/ml。2.根据权利要求I所述的无血清培养基，其特征在于，其必要组成为MDM17. 7g/L、L-谷氨酰胺5mM、碳酸氢钠3. 024g/L、Hepes 5mM、重组人胰岛素10mg/L、重组人转铁蛋白10mg/L、重组人白蛋白4g/L、2-巯基乙醇55nM、原儿茶酸I. 5mmol/L、脂质O. 5mg/L、氨基酸5g/L、维生素 8mg/L、微量元素 Zmg/UMuronic.RKS 100mg/L、氢化可的松 50ng/ml、维生素C 50mg/L、粘接胺或重组人纤连蛋白5mg/L、黄体酮15ng/ml、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、血清素 2mg/L、EGF 10ng/ml、b-FGF 10ng/ml、PDGF-BBIOng/ml、IGF-I lOng/ml。3.根据权利要求I或2所述的无血清培养基，其特征在于，还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵磷脂 10-20mg/L、IL-3 1-lOng/ml、GM-CSF 1-lOng/ml、TGF- β 11-lOng/ml。4.根据权利要求I或2所述的无血清培养基，其特征在于，还包含丙酮酸钠110mg/L、大豆卵憐脂 15mg/L、IL_310ng/ml、GM-CSFlOng/ml、TGF-β 110ng/ml。5.权利要求1-4任一项所述无血清培养基在MSC培养中的应用。全文摘要本专利技术涉及生物领域，公开了一种无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、Hepes、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人白蛋白、2-巯基乙醇、原儿茶酸、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、氢化可的松、维生素C、粘接胺或重组人纤连蛋白、黄体酮、腐胺、肝素、血清素、EGF、b-FGF、PDGF-BB、IGF-I。本专利技术所述无血清培养基化学成分明确、无动物源、无血清，培养细胞安全、理想，避免了掺杂动物成分和批次的不稳定性，培养间充质干细胞结果显示其细胞总数、细胞表型和分泌细胞因子均正常，具有良好的工业应用前景。文档编号C12N5/0775GK102827807SQ20121035060公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日专利技术者武晓云, 康会彦, 吕岩, 刘学敏, 王云虹, 王黎明, 高锦 申请人:北京京蒙高科干细胞技术有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无血清培养基，其必要组分为IMDM？17.7g/L、L？谷氨酰胺1？5mM、碳酸氢钠3.024g/L、Hepes？1？5mM、重组人胰岛素1？10mg/L、重组人转铁蛋白5？20mg/L、重组人白蛋白4？10g/L、2？巯基乙醇55nM、原儿茶酸1？5mmol/L、脂质0.1？1mg/L、氨基酸1？10g/L、维生素1？10mg/L、微量元素1？5mg/L、100？500mg/L、氢化可的松1？50ng/ml、维生素C？1？50mg/L、粘接胺或重组人纤连蛋白1？5mg/L、黄体酮10？20ng/ml、腐胺1？10mg/L、肝素1？10IU/mL、血清素1？5mg/L、EGF？1？10ng/ml、b？FGF？1？10ng/ml、PDGF？BB？1？10ng/ml、IGF？I？？1？10ng/ml。FDA00002161525900011.jpg

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：武晓云，康会彦，吕岩，刘学敏，王云虹，王黎明，高锦，
申请(专利权)人：北京京蒙高科干细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：