羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法及其纯化培养方法技术

本发明专利技术公开了一种从人和哺乳动物羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法，包括：对从胎盘剥离的羊膜进行预处理；机械去除预处理后的羊膜海绵层和上皮层，获得羊膜组织；将羊膜组织切割成预设大小，将切割后的羊膜组织与胶原酶IV溶液混合，消化，弃掉消化所得上清液；将第一消化步骤后的羊膜组织与新鲜胶原酶IV溶液再次混合，消化，离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。无需研磨和过滤羊膜组织块，通过机械刮除和梯度分步消化法充分去除羊膜中上皮细胞和间质类干细胞，突破了现技术中无法从羊膜组织获得高纯度内皮祖细胞的技术难题。

Methods of obtaining endothelial progenitor cells from amniotic membrane and amniotic fluid and their purification and culture

The invention discloses a method for obtaining endothelial progenitor cells from human and mammalian amniotic membrane and amniotic fluid, including: pretreatment of amniotic membrane peeled from placenta; mechanical removal of amniotic sponge layer and epithelial layer after pretreatment to obtain amniotic membrane tissue; cutting amniotic membrane tissue into preset size, mixing the cut amniotic membrane tissue with collagenase IV solution, digestion, and discarding digestion The amniotic membrane tissue after the first digestion step was mixed with fresh collagenase IV solution again, digested, centrifuged, and the supernatant was discarded to obtain endothelial progenitor cells. Without grinding and filtering the amniotic tissue mass, the epithelial cells and mesenchymal stem cells in amniotic membrane can be fully removed by mechanical scraping and gradient step-by-step digestion, which breaks through the technical problem that high-purity endothelial progenitor cells cannot be obtained from amniotic membrane tissue in the current technology.

【技术实现步骤摘要】
羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法及其纯化培养方法
本专利技术属于生物工程
中细胞的分离和扩增技术，具体涉及一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法及其纯化培养方法。
技术介绍
内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPC)是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞，在各种生理和病理因素刺激下分化为内皮细胞，参与受损内皮的修复和血管新生，因此在心血管疾病尤其是动脉粥样硬化病变发展过程中起着重要作用。1997年，Asahara等证实EPC存在于成人外周血，首次在血管新生领域引入了干细胞的概念。随后相继研究发现骨髓、脐血、脂肪组织中有EPC的存在。传统的EPC主要采集自骨髓和脐血，然而骨髓采取不便，而且受到个人身体状况的限制；脐带血不但接取不便而且容易污染，脐血量也受限，并且脐血来源EPC需要HLA配型，同时同种异体输入可能存在免疫排斥等副作用。由于EPC来源有限，数量极其稀少，一方面增加了科研人员对内皮细胞研究的难度，另一方面，限制了内皮细胞在心血管系统疾病、各种组织损伤等疾病中的临床应用。羊膜是胎膜最内层薄膜，与覆盖在胎盘、脐带的羊膜层相连接，具有分泌羊水的功能。目前已有研究表明，羊膜中含有丰富的滋养细胞和大量不同的胶原，包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成份，正是因为这些细胞和成份使羊膜不仅可阻止白细胞浸润，而且能产生一些生长因子到羊水中，如：碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子-β(TGF-β)等，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，上皮细胞生长因子(EGF)。这些因子能够促进上皮、间质以及内皮类细胞的增殖、移行和分化。此外，由于羊膜组织是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，其表面人类白细胞抗原DR低表达，不表达HLA-A，B，C抗原，Andinolfi等于1982年首次报道了报道人羊膜细胞无免疫原性的特点。此外，羊膜组织和羊水系产后废弃物，无伦理学问题；而且由于羊膜组织细胞来源充分，因此羊膜作为一种新型、可靠的供体材料具有广泛的应用前景。目前国内外研究人员已经从羊膜中分离出能够贴壁的细胞群，然而由于羊膜组织结构复杂，一方面消化方式繁琐容易引入污染源，而且操作工艺难以控制和重复，另一方面所获得的细胞种类复杂，细胞分化潜能和趋势多样化。虽然近年来有研究者能从羊膜中分离出纯度较高的单一细胞种类，但是主要是以间质类的间充质干细胞为主，迄今为止，还没有从羊膜和羊水中获得纯度较高的内皮祖细胞的案例。例如申请号为201280040374.5(公开日期为2015.03.25)的专利技术名称为《利用羊膜来源的贴壁细胞治疗辐射损伤》和申请号为201710437293.3(公开日期为2017.9.26)的专利技术名称为《羊膜来源的贴壁细胞》的专利技术专利申请，均公布了一种从羊膜获得具有贴壁性能的一个细胞组合物的方法，其细胞群包含了造血干细胞、体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、内皮细胞、成血管细胞、内皮祖细胞、周皮细胞、心肌细胞、肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、胚胎干细胞、或经处理类似于胚胎干细胞在内的多种膜干细胞组合物。一方面，此专利中提供了一种可以从羊膜中获得具有分化生成血管样的细胞和细胞群，但是其很难从复杂的细胞混合物中分离出纯度较高的内皮祖细胞；而且羊膜的消化过程步骤繁琐，需要多次使用其利用玻璃加工容器和循环水域管路自主构建的加工容器，并需多次羊膜碎片间歇搅拌和过滤，不但步骤繁琐，容易污染，而且操作过程难于控制，不容易形成稳定的标准作业程序SOP，难以实现产业化。例如申请号为201811259326.0(公开日期为2019.02.12)的专利技术名称为《一种人羊膜间充质干细胞的高效分离、扩增》的专利技术专利公布了一个采用两步酶消化法从羊膜中分离间充质干细胞的方法，首先使用剪刀把羊膜剪成大小均一的组织块后，用胰蛋白酶0.05％和EDTA0.02％混合，摇床震荡消化去除羊膜上皮干细胞(37℃，145rpm/min)，共消化两次，每次15min，中间使用生理盐水清洗去除上皮细胞后再次加入胰蛋白酶和EDTA消化酶；然后再用胶原酶Ⅰ0.1％和DNaseI0.02％消化1.0h，分离获得羊膜间充质干细胞。其操作步骤繁琐，消化过程中需要多次加入多种混合消化酶，消化酶配置复杂，不但容易污染，而且成本较高，也不利于产业化制备，此外，通过此消化获得的细胞是以间充质为主的干细胞群。本专利技术的目的是提供一种从羊膜和羊水中收集数量较多，纯度较高的血管内皮祖细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞分离方法、培养方法及制备的内皮祖细胞，能够从羊膜中获得纯度较高的内皮祖细胞，而且分离方法较为简便、操作过程易于控制，能够有效降低分离过程中受污染的可能性，从而实现羊膜、羊水来源的内皮祖细胞的产业化制备。本专利技术提供一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞，所述内皮祖细胞从人或哺乳动物围产物羊膜中获得。本专利技术还提供了一种羊膜来源的内皮祖细胞获取方法，包括以下步骤：预处理步骤，对从胎盘剥离的羊膜进行预处理；去除海绵层以及上皮细胞层步骤，采用机械分离方法去除预处理后的羊膜上的海绵层以及上皮细胞层，获得羊膜组织；第一消化步骤，将所述羊膜组织切割成预设大小，将切割后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～5)混合，置于37℃培养箱消化1.0h～8.0h，用生理盐水清洗消化后的羊膜组织；第二消化步骤，将所述第一消化步骤后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～2)混合，置于37℃培养箱消化1.0h～2.0h，将消化液与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。在其中一个实施例中，所述胶原酶为I型胶原酶、II型胶原酶、III型胶原酶、IV型胶原酶中的任意一种；所述胶原酶溶液的浓度为0.05％～0.25％。在其中一个实施例中，在所述预处理步骤中，所述预处理包括含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理、去除绒毛膜处理以及去污处理。在其中一个实施例中，在所述去除海绵层以及上皮细胞层步骤之前，还包括以下步骤：将预处理后的羊膜切割成第二预设大小，将切割后的羊膜用含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理。在其中一个实施例中，在所述去除海绵层和上皮细胞层步骤之后，还包括以下步骤：将羊膜组织用含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理。在其中一个实施例中，所述获取方法还包括以下步骤：将收集的羊水和/或保存过羊膜的保存液与含有青霉素、链霉素的生理盐水按体积比1：(0.5～1.5)混合后离心，弃去上清液，将得到的细胞沉淀与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。本专利技术还提供了一种羊水来源的内皮祖细胞获取方法，包括以下步骤：将收集的羊水和/或保存过羊膜的保存液与含有青霉素、链霉素的生理盐水按体积比1：(0.5～1.5)混合后离心，弃去上清液，将得到的细胞沉淀与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。本专利技术还提供了一种内皮祖细胞，所述内皮祖细胞采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞，其特征在于，所述内皮祖细胞从人或哺乳动物围产物羊膜中获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种羊膜和羊水来源的内皮祖细胞，其特征在于，所述内皮祖细胞从人或哺乳动物围产物羊膜中获得。


2.一种羊膜来源的内皮祖细胞获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
预处理步骤，对从胎盘剥离的羊膜进行预处理；
去除海绵层以及上皮细胞层步骤，采用机械分离方法去除预处理后的羊膜海绵层以及上皮细胞层，获得羊膜组织；
第一消化步骤，将所述羊膜组织切割成预设大小，将切割后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～5)混合，置于37℃培养箱消化1.0h～8.0h，用生理盐水清洗消化后的羊膜组织；
第二消化步骤，将所述第一消化步骤后的羊膜组织与胶原酶溶液按体积比为1：(1～2)混合，置于37℃培养箱消化1.0h～2.0h，将消化液与生理盐水混合后离心，弃去上清液，获得内皮祖细胞。


3.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述胶原酶为I型胶原酶、II型胶原酶、III型胶原酶、IV型胶原酶中的任意一种；所述胶原酶溶液的浓度为0.05％～0.25％。


4.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在所述预处理步骤中，所述预处理包括含有青霉素、链霉素的生理盐水浸洗处理、去除绒毛膜处理以及去污处理。


5.如权利要求4所述的获取方法，其特征在于，在所述去除海绵层以及上皮细胞层步骤之前，还包括以下步骤：
将预处理后的羊膜切割成第...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亚，李志刚，杜颖，王煜骏，丁炜，阮志，王颖颖，
申请(专利权)人：北京京蒙高科干细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11