本发明专利技术公开了一种用于单个核细胞分离的组合物及复方淋巴细胞分离介质。本发明专利技术所述复方淋巴细胞分离介质配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料安全性高，回收的淋巴细胞纯度及淋巴细胞回收率与常规分离介质对照组无显著性差异；经分离得到的淋巴细胞，在增殖、形态学、表面标记物及杀瘤活性测试四项指标中均与对照组有相当的效果，具有良好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种复方细胞分离介质及细胞分离方法。
技术介绍
细胞治疗技术如免疫细胞治疗、干细胞治疗极大的推动了现代医学技术的发展。 在细胞治疗过程中，目标细胞的采集与分离是的一个重要步骤。高纯度目标细胞的获取是得到优良质量的细胞终产品即效应细胞的前提。在细胞治疗过程中，除了需要用到治疗用的效应细胞外，还有一类为获取效应细胞而用到的辅助产品即细胞治疗辅料，用于效应细胞的分离、生长、存储、运输及输注等诸多环节，由于不在细胞治疗的终产品中出现，其重要性通常被忽略。密度梯度离心法(Density Gradient Centrifugation)作为一种传统的分离技术，用于细胞分离已经存在了半个世纪。基于密度梯度离心法的细胞分离介质产品即细胞治疗辅料，例如GE公司的Ficoll-PaquePLUS，已成为利用密度梯度离心法进行细胞分离的常规介质，特别是用于淋巴细胞的分离，其说明书推荐的相应操作步骤也已成为本领域技术人员公知的操作步骤。一般步骤包括在离心管中加入一定体积的淋巴细胞分离介质，待分离的血液样品平铺于分离介质上，接着对其在恒定温度下进行低速离心。样品中各细胞群将由于密度差异分布在离心管的不同部位，例如，如果分离介质具有与目标细胞群相同的密度，目标细胞将富集在分离介质层与样本层的交界面，用吸管将该层细胞吸出就达到了对目标细胞群的分离。由于Ficoll-Paque PLUS本身并不在终产物中出现，其属于一种典型的细胞治疗辅料。淋巴细胞作为一种效应细胞，广泛存在于人外周血液、骨髓或人脐带血中。高纯度的淋巴细胞的获取对于疾病的细胞学诊断、成分输血、治疗用细胞产品的制备等具有非常重要的意义。淋巴细胞分离介质是具有恒定密度、渗透压及PH值的混合体系。国际上传统的分离介质包括 GE Healthcare 公司的产品 Ficol 1-Paque PLUS、Ficol 1-Paque PREMIUM ；Axis-Shield 公司的产品 Lymphopi^p ；Sigma 公司的产品 Histopaque 1077 ;以及Mediatech 公司的产品Cellgro Lymphocyte Separation Medium(LSM)等。上述商品化的淋巴细胞分离介质以Ficoll 400(聚蔗糖400)和泛影酸钠为主要成分，密度在1. 073g/ cm3 和 1. 084g/cm3 之间，渗透压在 ^OmOsmol/kg 和 3IOmOsmol/kg 之间，pH 在 6 和 9 之间。 为了提高产品的技术标准以适应细胞治疗特殊行业要求，GE Healthcare公司在2005年推出的产品Ficoll-Paque PREMIUM不仅依据IS013485 :2003将生产在受到严格控制的环境中进行，更是根据欧洲GMP附件1中“无菌医药产品的制造”和美国药典USP<1043>关于细胞治疗辅料的建议，将内毒素控制在了 0. 12EU/ml的范围内，这个标准符合了静脉注射用药物对内毒素含量的要求。尽管如此，截至目前全球仍没有一种分离介质宣称可以用于临床治疗用途；上述产品的包装说明书和使用指导中均明确指出该产品的适用范围为研究而非体外诊断和治疗用途。除法规因素外，产品特性不明确是限制其临床使用的另一个重要因素。在淋巴细胞的工业化生产过程中，细胞分离介质是仅次于培养基外，与细胞接触时间最久的外源物质。在标准的分离过程中，细胞必须与分离液接触15-45分钟的时间，以达到最佳分离效果。在这段时间内，分离液中各组分可能通过被动扩散、细胞的主动运输、胞吞/胞饮作用、表面黏附等途径，在细胞内部蓄积，且此部分蓄积成分，很难通过常规的洗涤从分离得到的目标细胞(例如淋巴细胞)中完全去除。尽管常规理化指标及菌落、内毒素等生化指标外已达到较高标准，但原料组分的不确定性给细胞分离介质的临床应用带来了极大的障碍。例如，Ficoll-Paque 是一套密度为1. 077g/cm3的均质混合体系，每IOOml混合液中含有5. 7g 聚蔗糖 400 (Polysaccharide 400，即 Ficoll400)、9g 泛影酸钠(sodium diatrizoate)、0· 0231g EDTA(calcium disodium ethylenediamintetraacetic)。体系中的泛影酸钠和EDTA分别被用于血管造影及治疗血铅中毒，其药学相关数据已被阐明，安全性得到了保证。然而，Ficoll-Paque 临床应用的最大障碍源于体系中的主体成分聚蔗糖 400 (Ficoll 400), Ficoll 400并无临床应用，其毒理学、药物代谢动力学特性均没有相关数据支撑。密度梯度离心法分离淋巴细胞已成为生物医学诸多领域中不可缺少的试验技术之一，而分离介质的配方选择是密度梯度离心法中的技术核心。早在1968年B0yum等人逐步建立了以Ficoll 400和甲泛影钠(2，4，6-三碘-3-乙酰氨基-4-(N-甲乙酰氨基) 苯甲酸钠)为主配方的混合分离体系(B0yum,A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl， 1968,97 :77-89 ； B0yum, A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl，1968，97 :31-50 ; B0yum,A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl，1976，5 :9-15 ；)，同时开发了密度梯度离心这一简单快速的纯化细胞的方法，并成功将它们用于分离人血液样本中的白细胞。基于 B0yum等人的先驱工作成果，许多研究者将Ficoll 400-碘化密度梯度介质的混合体系进一步完善并最终该确立了利用泛影酸钠(2，4，6_三碘-3，5-二乙酰氨基苯甲酸钠)替代甲泛影钠组成Ficoll 400-泛影酸钠优化体系，该分离介质配方在世界范围内广泛得以应用。Ficoll 400和泛影酸钠的选择并不是偶然的。Ficoll 400是由蔗糖和环氧氯丙烷通过化学合成而得到的高分子量聚合物，可溶于水，其化学结构高度分支化形成球型，斯托克斯半径为5nm左右。其化学结构决定了 Ficoll 400具有分离介质适宜的特性，比如相对密度和特性粘度。Ficoll 400最大水溶液密度可达1. 23g/cm3(陈培刚，实验室仪器， 1990,4:9-15)，这已大于血细胞中密度最大的红细胞，因此分离谱广泛；而特性粘度则较低，为17ml/g，使分离过程更加高效。泛影酸钠则是一种适宜与Ficoll 400形成低粘度高密度溶液的化合物，在医学上用作X光造影剂。在典型的分离淋巴细胞的操作中，采用等量的平衡盐溶液对抗凝剂(比如肝素、 枸橼酸钠)处理过的血样进行稀释，然后将其小心铺在装入离心管的分离介质层上，维持界面清晰。在室温下进行短时低速离心(比如400g，30-40min)后，密度为1. 077g/cm3的淋巴细胞、单核细胞由于无法穿透密度更高的分离介质层而在血浆与分离介质层交界面处富集，而红细胞和粒细胞则由于密度较大而沉降在离心管底部。因此，淋巴细胞和单核细胞将在血浆层和分离介质层交界面的细胞条带处收获，继而通过对收获的细胞洗本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵侃，樊晓翔，高长青，丁银巧，高锦，
申请(专利权)人：北京京蒙高科干细胞技术有限公司，北京市星奥同创科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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