环境介质有机提取物同步纯化并逐级分离的方法技术

本发明专利技术公开了环境介质有机提取物同步纯化并逐级分离的方法，属于环境分析领域。其步骤为：水样通过滤膜的悬浮物保存，将固体样品冷冻干燥后研磨或粉碎并过筛，得到固相样品；过滤后的水样进行富集，萃取完毕后，真空干燥，有机溶剂洗脱固相萃取柱，洗脱液浓缩；过筛后的非生物样品的固相样品进行索氏提取，提取液浓缩定容；生物样品，用有机提取物先富集，再利用ＧＰＣ除大分子有机物及色素，最后富集；取弗罗里硅土干燥，将步骤（２）浓缩得到的样品溶液加入弗罗里硅土柱分离，有机溶剂连续洗脱，将流出液收集并浓缩，分别用于化学分析与毒性测试。本发明专利技术采用原理相同的提取、纯化方法应用于不同的环境介质，能有效的进行混合体系有机提取物浓度及毒性的比照。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种应用于不同环境介质的前处理方法，更具体的说是针对水、底泥、土壤、颗粒物及生物样的复合有机提取物同溶剂萃取，同柱纯化与逐级分离相结合的前处 理方法。
技术介绍
近十几年来，随着我国工业化、城市化的进程加快，大量有机污染物进入到水体、 土壤和大气等环境介质中，这些污染物大多具有浓度低、毒性大等特点并且在环境中存留 时间长。我国环境保护部门已经投入大量精力进行常规有机污染物(如硝基苯类和农药类 等)的监测，这些化合物的常规检测一般要有大型仪器的支持，如气相色谱、液相色谱、气 质联用和液质联用等等，这些大型仪器造价高使用费用昂贵，而且环境体系复杂，有机物种 类繁多，相互作用严重，很难对可能引起毒性的所有污染物进行监测，昂贵的分析检测技术 已经越来越难以满足环境管理决策部门和广大人民群众的需求。而针对高污染或微污染场 地的一种或几种毒性效应，进一步确定导致效应的污染物特征的方法，逐渐引起人们的关 注，该方法也能为区域污染评价、污染削减及污染控制提供有效途径。 长期以来，针对于不同介质中有机物的提取经常采用不同的萃取剂，这样就会导 致总提取物成分的差异，进而对毒性效应的综合评价造成困难；以往对于有机提取物的纯 化往往对于不同的目标化合物采用分柱纯化的方法，这样不仅是资源的浪费而且不具有可 比性，也不利于化学分析与毒性效应评价的有效结合。《应用生态学报》2003年第14巻第1期上105页公开了一篇有关化工废水毒性追 踪的文章《以毒性鉴别评价法评价化工废水处理效果的研究》，其中叙述的方法是引用美国 EPA毒性鉴别评价(Toxicity Identification Evaluation, TIE)法，利用pH调节及络合 等方法鉴别致毒物质性质以达到毒性追踪的目的。该方法相对于以前的方法进步不少，可 以同时做到毒性的鉴定及追踪，但该方法繁杂耗时，只能针对高污染水体进行急性毒性鉴 定，无法应用于人们日益关注的慢性毒性物质的提取及分离，而且该方法只涉及水体，无法 结合其它介质讨论导致效应的污染物特征。 通过检索发现国内外文献没有公开有针对不同介质环境样品及生物样的有机提 取物慢性毒性来源鉴定及追踪的方法。
技术实现思路
1.专利技术要解决的技术问题 针对现有的不同介质中有机物的提取采用不同的萃取剂，这样就会导致总提取物成分的差异，不具有可比性，本专利技术的目的是提供环境介质有机提取物同步纯化并逐级分离的方法，针对不同介质有机物将富集、纯化、分离于一体的系统方法，可以结合有机提取物的一类或几类毒性效应，用于确定导致效应的污染物特征。2.技术方案 本专利技术的原理环境中的有机污染物具有低浓度高毒性等特点，因此必须对不同 介质中的有机物进行必要的提取浓縮。本方法采用相同的提取剂(正己烷与二氯甲烷)和 洗脱剂(正己烷，二氯甲烷与甲醇)对不同介质中有机物进行提取。利用HLB固相萃取柱串 联富集水体中不同极性的有机物，并利用相似相容的原理洗脱，洗脱液浓縮后可进行总毒 性的测试和进一步的分级分离，进而进行毒性来源的追踪。将总提取物应用于不同靶位的 毒性测试，然后对可致毒点位的总提取物利用吸附柱层析法进行不同极性有机物的分离， 常用的吸附剂有弗罗里硅土和硅胶，并利用尺寸排阻色谱柱进行不同分子量有机物的进一 步分离。最后针对次级组分进行毒性鉴定以确定导致效应的污染物特征。 本专利技术的技术方案如下 ，其步骤为 (1)水样通过滤膜过滤，将滤膜上的悬浮物保存；将底泥土壤样品、生物样品或固 体悬浮物冷冻干燥后研磨或粉碎并过筛，得到固相样品； (2)过滤后的水样以3 5mL/min的速度通过串联的HLB固相萃取柱进行富集，萃 取完毕后，萃取柱负压真空干燥，依次用正己烷、二氯甲烷/正己烷、甲醇/二氯甲烷的溶剂 洗脱HLB固相萃取柱，洗脱液浓縮至lmL ;过筛后的非生物样品的固相样品进行索氏提取， 提取液为正己烷/二氯甲烷，提取液浓縮，用二氯甲烷定容至lmL;对于生物样品，用有机提 取物先富集到5mL，再利用GPC(凝胶渗透色谱)除大分子有机物及色素，最后富集到lmL; (3)称取弗罗里硅土，利用移液管湿法填柱于玻璃管中，加入无水Na2S04干燥，将 步骤(2)浓縮得到的样品溶液加入弗罗里硅土柱分离，先后用正己烷，正己烷/二氯甲烷， 二氯甲烷/甲醇连续洗脱，将三份流出液收集并浓縮，分别用于化学分析与毒性测试。 步骤(2)后可以将得到的总提取物利用不同的体外细胞毒性测试方法进行毒性 检验，筛选有效应点进一步利用柱层析法和GPC法分级分离； 步骤(3)后利用GPC法(凝胶渗透色谱法)，条件为填料Bio-Beads S-X3 ;内径 3cm ;长度20cm ;淋洗液为体积比为1 : 1的环己烷和乙酸乙酯；流速4 5mL/min。对次 级致毒组分再次分离，每1-4分钟取样一次，进行毒性测试，进一步判断主要致毒污染物性 质。 本专利技术步骤(1)中滤膜为0.45ym滤膜。所用筛子为200目。 一般取水样体积为 2L。底泥(土壤)和生物样采集量不少于lOOg(干重)。 步骤(2)采用两个HLB固相萃取柱串联(也可采用两根以上)。专利技术中用到的正 己烷及二氯甲烷均为农残级，甲醇为HPLC级。步骤(2)中的洗脱溶剂为5 10mL正己烷、 8 12mL体积比为2 4 : 1的二氯甲烷/正己烷和8 12mL体积比为2 4 : l的甲 醇/二氯甲烷。索氏提取的提取液为200mL体积比为1 : 1 2的正己烷/二氯甲烷。 步骤(2)中得到的生物样品的有机提取物用匿SO溶剂替换后进行毒性鉴定，毒性 测试可采用斑马鱼胚胎实验，大型藻暴露试验，内分泌干扰毒性细胞暴露实验，生殖细胞毒 性试验，彗星实验等简单易行的体外暴露实验。 步骤(3)中玻璃管长45cm，内径lcm，试验中尝试各种洗脱体积及配比以获得最 优条件。步骤(3)中称取8 12g弗罗里硅土，利用移液管湿法填柱于玻璃管中，加入无 水化25040. 5 1. 5g干燥，将步骤(2)浓縮得到的样品溶液加入弗罗里硅土柱分离，先后用 80 120mL正己烷，80 120mL体积比为2 4 : 1的正己烷/ 二氯甲烷，100 140mL体积比为1 2:i的二氯甲烷/甲醇连续洗脱。3.有益效果 本专利技术提供了一种，采用原理相同的提取、纯化方法应用于不同的环境介质，能有效的进行混合体系有机提取物浓度及毒性的比照，将化学分析与毒性检验有效结合；针对多种目标化合物采用同柱纯化的方法，简单易行且具有可比性；利用填充柱分离(不同极性分离)和体积排阻色谱分离(不同分子大小分离)的手段进行毒性鉴定以确定导致效应的污染物特征。实验结果表明，该方法利用不同化合物极性的差异将混合体系先分离为F1， F2， F3组分，对于常见的环境有机污染物，其弱极性组分(Fl)中的26种PCB与中极性组分(F2)中的PAH及F2中PAH与极性组分(F3)中的常见酚类物质可以达到完全分离，除p， p' DDE外其余七种有机氯农药也均在F2组分中。其中PCBs的加标回收率达到95%以上，0Cs的回收率在97%以上，PAHs回收率在80%以上，F3中几种酚类的回收率为90X以上。本专利技术利用填充的弗洛里硅土柱进行初步分离，确定污染物性质，再利用GPC进而追踪确定导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环境介质有机提取物同步纯化并逐级分离的方法，其步骤为：　　　　（１）水样通过滤膜过滤，将滤膜上的悬浮物保存；将底泥土壤样品、生物样品或固体悬浮物冷冻干燥后研磨或粉碎并过筛，得到固相样品；　　　　（２）过滤后的水样以３～５ｍＬ／ｍｉｎ的速度通过串联的ＨＬＢ固相萃取柱进行富集，萃取完毕后，萃取柱负压真空干燥，依次用正己烷、二氯甲烷／正己烷、甲醇／二氯甲烷的溶剂洗脱ＨＬＢ固相萃取柱，洗脱液浓缩至进样检测所需体积；过筛后的非生物样品的固相样品进行索氏提取，提取液为正己烷／二氯甲烷，提取液浓缩，用二氯甲烷定容至进样检测所需体积；对于生物样品，用有机提取物先富集到５ｍＬ，再利用ＧＰＣ除大分子有机物及色素，最后富集到进样检测所需体积；　　　　（３）称取弗罗里硅土，利用移液管湿法填柱于玻璃管中，加入无水Ｎａ↓［２］ＳＯ↓［４］干燥，将步骤（２）浓缩得到的样品溶液加入弗罗里硅土柱分离，先后用正己烷，正己烷／二氯甲烷，二氯甲烷／甲醇连续洗脱，将三份流出液收集并浓缩，分别用于化学分析与毒性测试。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于红霞，史薇，曹福，苏冠勇，韦斯，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]