基于干细胞分泌因子的培养基及其制备和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种基于干细胞分泌生物活性因子培养基及其制备和使用方法。其制备过程为：收集干细胞培养扩增过程中更换的废弃培养液；将其进行冻融、低温分离、超滤和浓缩，得到富含丰富生物活性因子的溶液；测定浓缩物所含的蛋白浓度，按照一定的比例添加到基础培养基中。通过该方法制备的培养基可用于各种间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、人正常肝细胞等细胞的培养。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于干细胞分泌生物活性因子培养基及其制备和使用方法。其制备过程为：收集干细胞培养扩增过程中更换的废弃培养液；将其进行冻融、低温分离、超滤和浓缩，得到富含丰富生物活性因子的溶液；测定浓缩物所含的蛋白浓度，按照一定的比例添加到基础培养基中。通过该方法制备的培养基可用于各种间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、人正常肝细胞等细胞的培养。【专利说明】
本专利技术属于生物
，具体涉及收集干细胞培养液上清，离心浓缩干细胞体 外培养扩增过程中分泌的生物活性物质并加以应用。
技术介绍
干细胞是一类早期未分化的具有自我复制更新、高度增殖和多向分化的多潜能细 胞，近年来，干细胞已经从实验室研究逐渐过渡到临床。目前用于临床的移植干细胞类型 包括胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC)及内皮祖细胞 等。MSC具有多向分化潜能，不仅可以分化为造血基质细胞，还可以向成骨细胞、软骨细胞、 脂肪细胞、肌腱细胞、心肌细胞、基质细胞、内皮细胞、肝和胆道上皮细胞、肺上皮细胞等中 胚层细胞分化，同时又有向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆细胞分化的潜力。作为 一种组织干细胞，MSC不仅具有干细胞的共性，还有其独特的特点：来源广泛、易于体外培 养、具有高度的扩增能力且能保持良好的基因稳定性、能够与各种病毒载体相结合、免疫排 斥的概率低等。因此，随着MSC及其相关技术的日益成熟，MSC被人们认为是理想的种子细 胞，大量的应用于实验及临床研究。 既往认为，干细胞主要作为种子细胞通过移植后分化成靶组织细胞（如心肌和 内皮细胞，即横向分化）而发挥治疗作用。但是干细胞分化，特别是定向分化取决于周 围环境。越来越多的证据表明干细胞对组织器官修复及其保护作用不仅是干细胞的分化作 用，干细胞旁分泌的生物活性物质也发挥重要的作用。干细胞在所处的特定微环境中能够 产生一系列生长因子或配体，如白介素（IL)、干细胞生长因子（SCF)、粒细胞-巨噬细胞集 落刺激因子（GM-CSF)、转化生长因子-β (TGF-β )、表皮生长因子（EGF)、成纤维细胞生长 因子（FGF)、肝细胞生长因子（HGF)、胰岛素样生长因子（IGF)、神经生长因子（NGF)、血管内 皮细胞生长因子（VEGF)等，MSC通过这些因子参与造血支持、免疫调节等功能，同时这些因 子也能够与MSC相互作用，维持干细胞的增殖、更新和分化。骨髓MSC可分泌一些造血相关 因子，如 IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、白血病抑制因子（ILF)、GM-GSF 和SCF发挥造血支持作用。一些研究也证实了 MSC在一定条件刺激下还能够分泌出TGF- β、 VEGF、血小板衍生的生长因子（TOGF)、角质化细胞生长因子（KGF)和HGF。干细胞分泌的 活性物质影响血管细胞增殖、迁移、黏附和细胞外基质形成等血管生成的多个环节。多个研 究发现，种植于肝脏的MSC通过旁分泌形式分泌多种细胞因子和生长因子，如IL-10、TNF、 GM-CSF、HGF和NGF等在促进肝脏再生和修复的同时，抑制肝脏炎症反应、促进细胞外机制 (ECM )降解、改善凋亡诱导的肝损伤、提高血清清蛋白水平等。IGF-1、VEGF、HGF等具有抗 血管内皮和肝细胞凋亡的作用；而HGF除抗凋亡外，还能促有丝分裂抗纤维化。除表达 相关细胞因子外，MSC还表达与骨形成相关的因子，如成骨特殊因子-2 (0SF-2)和BMP-1; 此外，也表达神经细胞粘附分子neuropilin、NGF和脑衍生神经营养因子（BDNF)，这些因 子可以参与中枢神经系统的神经再生，促进损伤脑组织的生存与重塑。此外，MSC在增殖 的过程中能分泌一些粘附基质分子(纤连蛋白、层粘连蛋白等）能促进细胞的粘附、贴壁。 MSC目前已经广泛应用于移植物抗宿主反应、心力衰竭、成骨不全、脊髓损伤、晚期 扩张型心肌病、软骨病、中风、自身免疫性疾病等临床疾患，且已取得满意的临床效果。然 而，MSC在组织中的数量极其微小，例如在骨髓细胞中仅占0. 001 %?0. 01%。从组织中分 离获取的干细胞非常有限，所以目前在实验及临床研究人们使用胎牛血清培养基、人血清 培养基、人富血小板血浆、人血小板裂解液和化学成分明确的无血清培养基等进行大量的 体外扩增以满足实验与临床研究。 但目前人们无论在实验研究，还是GMP生产中只关注MSC的生产，对MSC培养的上 清液当作生物垃圾废弃，这极大地浪费了 MSC在培养过程中分泌的生物活性物质。而且目 前在MSC的临床治疗中，无血清培养基的使用大大增加了 MSC治疗的成本，所以如果能将 MSC培养的上清液重新回收利用，那么将具有较大的价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以支持各种来源MSC体外分离、培养、扩增用的培 养基及其制备和使用方法，本专利技术培养基同时可以支持人脐静脉血管内皮祖细胞（HUVEC) 和正常肝细胞L02的生长。 本专利技术利用干细胞在进行体外培养、增殖过程中分泌的大量的生物活性因子具有 促干细胞体外扩增的特点，通过体外分离、培养人脐带、羊膜、胎盘和脂肪等组织的MSC，收 集培养过程中的上清液，将其进行冻融、低温分离、3K的超滤膜过滤和浓缩，得到富含丰富 生物活性因子的浓缩溶液；测定浓缩物所含的蛋白浓度，按照0. 1-10 mg/mL的比例添加到 基础培养基中，制备成完全培养基用于多种细胞的体外培养。 本专利技术提供的基于干细胞分泌因子培养基的制备及使用方法具有以下有益效 果： 本专利技术提供的方法制备的培养基不需要添加FBS，亦可支持细胞的各种原代培养。 本专利技术提供的富含多种生长因子的浓缩物可以作为细胞培养的添加剂，为医学特 殊细胞培养和医学特殊细胞的治疗和鉴定开辟新的培养添加物，同时MSC分泌物也可应用 于人体美容、皮肤外用、美白嫩肤、延缓衰老等各种化妆品。 本专利技术利用MSC在进行体外培养、增殖过程中分泌的大量的生物活性因子的特 点，收集MSC培养上清夜，提纯、浓缩其中的活性因子或物质再次用于细胞的体外培养，这 种技术将废弃细胞培养上清液重复利用，不仅节省了成本，同时大大降低废弃细胞培养上 清液作为生物垃圾对自然环境和人类健康存在的潜在危害。 本专利技术提供的基于干细胞分泌因子培养基的制备方法可以将前期使用的无动物 源、人源、无血清MSC培养基重复利用，不仅大大节省了 MSC无动物源、人源、无血清培养成 本，同时也大大降低MSC作为细胞治疗的成本。 【专利附图】【附图说明】 图1为本专利技术所述培养基（a)和10% FBS培养基（b)培养原代MSC 7天细胞形态 图； 图2为本专利技术所述培养基（a)和10% FBS培养基（b)培养的MSC分化实验染色结 果； 图3示本专利技术所述培养基（a)和10% FBS培养基（b)培养EPC 16小时细胞形态 图； 图4为本专利技术所述培养基（a)和10% FBS培养基（b)培养L02 16小时细胞形态 图； 【具体实施方式】 本专利技术公开了一种基于干细胞分泌生物活性因子培养基的制备及使用方法，本领 域技术人员可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于干细胞分泌生物活性因子的培养基，其制备方法包括：提取干细胞、体外培养、扩增传代、收集细胞培养上清液；‑20℃保存、融化上清液并混合、低温分离、超滤和浓缩，得到高纯度的富含多种生物活性因子的浓缩物添加剂；完全培养基的制备。特征是干细胞分泌生物活性因子来源于人脐带、羊膜、骨髓、脐血、胎盘和脂肪等组织的间充质干细胞，其富含多种生物活性因子和粘附、基质因子等物质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：武晓云，康会彦，刘学敏，吕岩，王云虹，王黎明，刘洁，高锦，
申请(专利权)人：北京京蒙高科干细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11