本申请公开了一种人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法。所述的人脂肪干细胞增殖促进剂由胰岛素、氢化可的松、甲状旁腺激素、雌二醇、睾酮、血小板衍生生长因子-AB、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子、L-抗坏血酸、生物素、地塞米松、IGF-I和SCF组成。本发明专利技术应用于脂肪干细胞的增殖传代培养，不但能特异性促进脂肪干细胞生长速度和扩增数量程几何级数增长，又能抑制其过早分化成熟，避免干细胞在培养中凋亡或早衰，保持脂肪干细胞旺盛活跃的分化潜能。在脂肪干细胞培养领域有着良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术及细胞工程领域，特别涉及一种人脂肪干细胞增殖促进剂。
技术介绍
人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖I倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。ADSCs具有与骨髓间充质干细胞基本相同的细胞免疫表型，经流式细胞仪分析CD9，CD10, CD 13, C D29，CD44, CD49d, CD49e, CD54, CD55, CD59, CD90, CD105, CDl17，CD146, CD166, STRO-1 均为阳性，而⑶31，⑶34，⑶45均为阴性。最大的区别是ADSCs表达⑶49d，不表达CD106;而正好相反，BMSCs表达CD106,不表达CD49d。目前常用的ADSCs分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械和酶处理方法除去红细胞等成熟细胞后，利用饲养层细胞与采用含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人脂肪干细胞增殖促进剂，用于提高继代增殖效率。常用的培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。根据本专利技术的一个方面，提供一种人脂肪干细胞增殖促进剂，其特征在于由胰岛素、氢化可的松、甲状旁腺激素、雌二醇、睾酮、血小板衍生生长因子-AB、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子、L-抗坏血酸、生物素、地塞米松、胰岛素样生长因子IGF-I和人干细胞因子SCF组成。在加入人脂肪干细胞培养基后人脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰岛素浓度为O. ΓΙΟ μ g/mL,氢化可的松浓度为ΙΟ—10 5X 10_9mOl/L、甲状旁腺激素浓度为2X 10_1(1 7X lO.mol/L、雌二醇浓度O. 2^3. 5ng/mL、睾酮浓度为O. 8 15ng/mL、血小板衍生生长因子-AB浓度为8ng/mL、表皮生长因子浓度为2 16ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子浓度为2 20ng/mL、L-谷氨酰胺优选浓度为O. r4mmol/L,2-巯基乙醇浓度为O. 07、. 15mmol/L、白血病抑制因子浓度为l 7ng/mL、L-抗坏血酸浓度为10 80 μ g/mL、生物素浓度为1(Γ45 μ g/mL、地塞米松浓度为Kr8 5X l(T8mol/L、IGF-I浓度为I 10ng/mL和SCF浓度为O. 8 15ng/mL。其中胰岛素最优选浓度为6. 25 μ g/mL,氢化可的松最优选浓度为I X 10_9mol/L,甲状旁腺激素最优选浓度为5X l(rlclmol/L,雌二醇最优选浓度为Ing/mL,睾酮最优选浓度为4ng/mL,血小板衍生生长因子-AB最优选浓度为4ng/mL，表皮生长因子最优选浓度为10ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子最优选浓度为10ng/mL,L-谷氨酰胺最优选浓度为2mmol/L, 2-巯基乙醇最优选浓度为O. lmmol/L,白血病抑制因子最优选浓度为5ng/mL, L-抗坏血酸最优选浓度为50 μ g/mL,生物素最优选浓度为33 μ g/mL,地塞米松最优选浓度为10_8mol/L, IGF-I最优选浓度为5ng/mL, SCF组成最优选浓度为5ng/mL。本专利技术提供对维持细胞指数生长的激素和各种生长因子作用如下insulin胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸hydrocortisone氢化可的松刺激干细胞的生长，保证细胞功能parathyroid hormone甲状旁腺激素刺激干细胞的生长estradiol雌二醇刺激干细胞的生长,保证细胞功能 testosterone睾酮刺激干细胞的生长,保证细胞功能PDGF-AB血小板衍生生长因子-AB :促细胞分裂剂，可刺激成纤维细胞和其他多种细胞分裂增殖。EGF表皮生长因子对多种组织细胞有强烈的促分裂作用bFGF碱性成纤维细胞生长因子能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。L-Glutamine L-谷氨酰胺增加细胞的体积，促进细胞增长2-Mercaptoethanol 2_巯基乙醇可以保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进细胞的贴壁和增殖。LIF白血病抑制因子具有抑制干细胞分化等功能，用于维持培养中的干细胞处于未分化状态。L-ascorbic acid L-抗坏血酸抗氧化剂皆能促进干细胞的生长，增加成活率。biotin生物素生物素又被称作维生素H，属于水溶性B族维生素家族，参与帮助脂肪细胞内物质正常的合成与代谢。促进干细胞生长。Dexamethasone地塞米松属于肾上腺皮质激素类药物，在细胞培养过程中起到生长因子的作用，促进细胞的增殖分化。IGF-I胰岛素样生长因子是一类多功能细胞增殖调控因子。在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。SCF人干细胞因子是一种广泛表达的I型跨膜糖蛋白，可促进干细胞成活、加速增殖。根据本专利技术的一个方面，提供的一种人脂肪干细胞增殖促进剂，包含对维持细胞指数生长的激素和各种生长因子，用于脂肪干细胞的增殖传代培养，不但能特异性促进脂肪干细胞生长速度和扩增数量呈几何级数增长，又要抑制其过早分化成熟，避免干细胞在培养中凋亡或早衰，保持脂肪干细胞旺盛活跃的分化的潜能，促进提取出的干细胞成活。附图说明图I是本专利技术中添加人脂肪干细胞增殖促进剂的基础培养基与未添加人脂肪干细胞增殖促进剂的基础培养基培养人脂肪干细胞生长曲线图；图2是本专利技术中使用普通基础培养基组培养人脂肪干细胞培养6天时细胞的形态；图3是本专利技术中使用人脂肪干细胞增殖促进剂培养人脂肪干细胞培养6天时细胞的形态；图4是本专利技术中使用人脂肪干细胞增殖促进剂培养人脂肪干细胞人脂肪干细胞端粒酶活性检测结果。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。实施例I :普通人脂肪干细胞基础培养基配制取900mL的DMEM/F12细胞培养液(从TAKARA BIO INC.购得)加抗生素青霉素 90000U，链霉素 90000U。调pH值用质量分数5% NaHCO3调节pH到7. 2。过滤除菌采用孔径O. 45μηι和O. 22μηι滤膜各一张，上层为O. 45 μ m,下层为O. 22um,以保证过滤效果。加小牛血清临用前将加入小牛血清定容至IOOOmL (从TAKARA BIO INC.购得)。实施例2 :制备一种含人脂肪干细胞增殖促进剂的增殖培养基A预定量为IOOOmL则取900mL的DMEM/F12细胞培养液(TAKARA BIO INC.)，加抗生素青霉素90000U，链霉素9本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人脂肪干细胞增殖促进剂，其特征在于:由胰岛素、氢化可的松、甲状旁腺激素、雌二醇、睾酮、血小板衍生生长因子？AB、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L？谷氨酰胺、2？巯基乙醇、白血病抑制因子、L？抗坏血酸、生物素、地塞米松、胰岛素样生长因子IGF？I和人干细胞因子SCF组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦阳，
申请(专利权)人：江苏瑞思坦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。