【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域,特别涉及一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法。
技术介绍
单克隆抗体药物具有特异性强、副作用小等临床优势,抗体药物直接与靶标结合,靶向特异性强,同时,抗体识别目标的灵敏度很高,用药量少;再加上抗体药物本身属于蛋白质,其在体内代谢与其他内在抗体和蛋白质过程相同,不会额外对肝肾造成负担,因而一般副作用很小,具有广阔的应用前景,目前主要用于肿瘤、自身免疫等疾病的治疗。抗体分子的基因结构较复杂,抗体的轻链L由C、V和J 3个基因簇编码,抗体的重链H由C、V、D和J 4个基因簇编码。V是抗体基因编码可变区,人的Svh基因数量约为100个,D基因片段为10-20个,Jh基因片段有9个;小鼠Vh的基因片段的数目约为250-1000种,D基因片段有12个,Jh基因片段有4个;抗体轻链分为K和λ 2个亚型,正常人血清免疫球蛋白K链:λ链约为2:1,Vk基因的数量约为100个;而小鼠95%的抗体轻链是K型,小鼠Vk基因片段约有250个,这些基因片段通过多种多样的重排,合成出的肽段再进一步进行L和H链组合,从而生成众多的抗体种类。目前,人们已经开发出多种抗体药物筛选的方法,如杂交瘤融合技术,噬菌体展示技术和酵母展示技术等。与传统的杂交瘤融合技术相比,抗体的体外表达技术具有效率高,操作简单,实 验周期短等优点(Clackson T, Nature, (1991) 352:624-628; Boder E,Nature Biotechnol, (1997) 15:553-557),其逐渐成为功能强大的抗体药 ...
【技术保护点】
一种巢式一步法RT?PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法,其特征在于:所述的方法步骤如下:(1)寡聚脱氧核糖核酸引物和接头设计根据NCBI和VBASE上已报道的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物,根据小鼠抗体重链和轻链的家族分类,重链可变区上游引物命名为VH1?VH13,下游引物命名为CH1;轻链可变区上游引物命名为VK1?VK19,下游引物命名为CK1;上述上游引物起始于小鼠重链和轻链可变区5’末端,下游引物终止于小鼠重链和轻链的恒定区;重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入linker接头,重链可变区上游引物带入的linker接头和轻链可变区上游引物带入的linker接头互补;重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入的linker接头序列如下:重链linker:5’?TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA?3’轻链linker:5’?GGCGCGCAAGCTACGGCCGATGT?3’;(2)一步法RT?PCR以单个B?cell为模板通过逆转录酶将重链、轻链可变区基因的mRNA逆转录为cDNA,然后以c ...
【技术特征摘要】
1.一种巢式一步法RT-PCR从单个B细胞扩增鼠源抗体重链和轻链可变区基因全序列的方法,其特征在于:所述的方法步骤如下: (O寡聚脱氧核糖核酸引物和接头设计 根据NCBI和VBASE上已报道的小鼠免疫球蛋白重链和轻链的V基因序列设计兼并引物,根据小鼠抗体重链和轻链的家族分类,重链可变区上游引物命名为VH1-VH13,下游引物命名为CHl ;轻链可变区上游引物命名为VK1-VK19,下游引物命名为CKl ;上述上游引物起始于小鼠重链和轻链可变区5’末端,下游引物终止于小鼠重链和轻链的恒定区;重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入linker接头,重链可变区上游引物带入的linker接头和轻链可变区上游引物带入的linker接头互补; 重链可变区上游引物和轻链可变区上游引物的5’端分别带入的linker接头序列如下:重链 linker:5,-TCGGCCGTAGCTTGCGCGCCTCCA-3’轻链 linker:5,-GGCGCGCAA...
【专利技术属性】
技术研发人员:张成,药晨江,景书谦,
申请(专利权)人:杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司,
类型:发明
国别省市:
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