本发明专利技术涉及耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立，具体方法为：分别用PTX干预OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞，然后换无PTX培养基，至细胞生长恢复正常即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高PTX的浓度，每次干预时间为24小时，最终获得保藏号为CCTCC C2014203和CCTCC C2014204的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。本发明专利技术的方法是通过密切观测细胞生长状态选择干预时机，建立的细胞模型耐药系数均处于较高水平且耐药稳定性好，因此可用于卵巢癌耐药机制、卵巢癌耐药逆转、预防化疗耐药和提高化疗敏感性方面的研究。
【技术实现步骤摘要】
耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立
本专利技术涉及细胞模型的建立，具体地说，涉及耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立。
技术介绍
卵巢癌是致女性死亡的首位生殖道恶性肿瘤，其治疗主要在肿瘤细胞减灭术的基础上紫杉醇联合铂类化疗，此方案初治治疗效果好，但易发生耐药，而耐药后再化疗效果很差。普通卵巢癌细胞株在研究卵巢癌耐药机制中存在局限性，而卵巢癌耐药细胞株更能从分子生物学角度来研究其耐药机制，有助于进一步寻找卵巢癌耐药后的治疗方法。中国期刊《肿瘤》2006年第8期，刊出的论文“卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/TAX300建立及基因表达谱分析”，采用反复大剂量紫杉醇冲击法，由亲本细胞OC3建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/TAX300，耐药株历时10个月建成，耐药性稳定，耐药指数为6.70。中国期刊《山东医药》2008年第48卷第6期，刊出的论文“卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药机制研究”，选用卵巢癌细胞株SKOV3，以浓度为300μg/ml的TAX反复大剂量冲击用药，培养8个月后建立了TAX耐药细胞株，命名为SKOV3/TAX，该细胞已反复传代3个月以上，结果SKOV3/TAX细胞耐药性稳定，耐药指数(RI)为10.57。中国期刊《中国药师》2008年第10期，刊出的论文“不同方法建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株对临床用药方案的启发”，用不同的诱导耐药方法培养紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol，A2780/(DDP+Taxol)，A2780/Taxol-1，具体方法是：采用逐步增加药物浓度和大剂量冲击两种方法处理细胞，直至细胞能在2.5μg·ml-1紫杉醇中稳定生长，MTT法检测A2780，A2780/DDP细胞对紫杉醇的药物半数抑制浓度(IC50)分别为(0.23±0.04)μg·ml-1和(0.26±0.02)μg·ml-1，采用逐步增加药物浓度诱导法历经九个月时间建立A2780的紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol-1，对紫杉醇的IC50为(6.63±0.31)μg·ml-1，耐药倍数为28.83。以上均通过逐步诱导的方法建立了耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，然而其耐药指数仍然较低，如果细胞模型要能用于耐药机制等研究，则要求具备良好的耐药稳定性。另外，目前尚无耐紫杉醇的OVCAR-3卵巢癌细胞株。综上所述，建立耐药指数更高、耐药稳定性更好的细胞模型仍然是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立方法。本专利技术的第二个目的是，提供一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。本专利技术的第三个目的是，提供所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的用途。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立方法，它包括以下步骤：a)培养OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞；b)OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞分别用PTX开始干预，然后换无PTX培养基，至细胞生长恢复正常即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高PTX的浓度，每次PTX的干预时间均为24小时；c)对干预后的OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞进行检测，获得耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号分别为CCTCCC2014203和CCTCCC2014204。实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：作为本专利技术的一种技术方案，所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号为CCTCCC2014203，细胞株命名为OV3R-PTX。所述的保藏号为CCTCCC2014203耐紫杉醇卵巢癌细胞模型可用于研究卵巢癌耐药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。作为本专利技术的另一种技术方案，所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号为CCTCCC2014204，细胞株命名为SK3R-PTX。所述的保藏号为CCTCCC2014204耐紫杉醇卵巢癌细胞模型可用于研究卵巢癌耐药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。本专利技术优点在于：本专利技术通过科学的方法建立了两株耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，建立细胞模型的过程不是机械式设置药物浓度梯度和定期传代，最后筛选出存活的细胞系，而是密切观测细胞生长状态，待达到细胞形态饱满，无漂浮死细胞，细胞密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高PTX的浓度，通过该方法建立了两株耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，其耐药系数均显著高于现有的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，且耐药稳定性好。所以本专利技术的第三个目的是此模型可用于卵巢癌耐药机制、卵巢癌耐药逆转、预防化疗耐药和提高化疗敏感性方面的研究。【具体实施方式】下面对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1一、材料OVCAR-3细胞、SK-OV-3细胞购自美国ATCC公司。紫杉醇(PTX)购自太极集团四川太极制药有限公司：30mg/5ml/支。紫杉醇工作液用细胞培养基(RPMI-1640+10％FBS，购自美国Gibco公司)配制。二、建株步骤1)OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞用RPMI-1640+10％FBS+100U/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素培养。2)两株细胞分别用PTX起始浓度为0.01μM开始干预，给予PTX24小时后换无药培养基(RPMI-1640+10％FBS+100U/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素)。3)待细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代(P)并提高PTX的浓度。母细胞OVCAR-3在第19代起(P19)到P20加0.01μMPTX干预，共3次，每次24小时；在P21，加0.1μMPTX干预1次；在P22-P32，加0.5μMPTX干预，共12次；在P33-34，加1μMPTX干预，共2次；在P34-P38，加5μMPTX干预，共10次。细胞生长良好，-80℃储存。母细胞SK-OV-3在P18起到P19加0.01μMPTX干预，共3次；在P20-P35，加1μMPTX干预，共13次。细胞生长良好，-80℃储存。上述细胞每次干预24小时后更换无PTX培养基，至细胞生长恢复正常(即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞)后再进入下一轮PTX干预。历时5个月，最终在OVCAR-3细胞株中PTX至5μM，标记为OV3R-PTX；在SK-OV-3细胞株中PTX至1μM，标记SK3R-PTX。OVCAR-3细胞共干预PTX28次，SK-OV-3细胞共干预PTX16次。耐药株建立过程中OVCAR-3共传19代，SK-OV-3共传17代。耐药株已于2014年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，OV3R-PTX保藏编号为CCTCCC2014203，SK3R-PTX保藏编号为CCTCCC2014204。4)计算半抑制浓度(IC50)和耐药系数(RI)。采用WST-1法(美国Roche公司)检测细胞存活率。每孔5000个OVCAR-3及OV3R-PTX细胞和每孔3000个SK-OV-3及SK3R-PTX细胞分别接种至96孔培养板，24小时后给予不同浓度的PTX(0，0.0001，0.001，0.01，0.1，0.5，1，5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立方法，其特征在于，它包括以下步骤：a)培养OVCAR‑3细胞和SK‑OV‑3细胞；b)OVCAR‑3细胞和SK‑OV‑3细胞分别用PTX开始干预，然后换无PTX培养基，至细胞生长恢复正常即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高PTX的浓度，每次PTX的干预时间均为24小时；c)对干预后的OVCAR‑3细胞和SK‑OV‑3细胞进行检测，获得耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。
【技术特征摘要】
1.一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，其特征在于，所述的细胞模型的保藏号为CCTCCC2014203。2.权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：许国雄，张凌云，
申请(专利权)人：复旦大学附属金山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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