SPAG6基因作为卵巢肿瘤诊断和治疗标志物的用途制造技术

本发明专利技术涉及SPAG6基因在卵巢肿瘤的诊断、治疗中的用途。本发明专利技术利用QPCR和Western blot方法证明SPAG6基因在卵巢肿瘤组织和正常组织中存在差异表达，体外用生长曲线、紫杉醇生长抑制试验检测SPAG6基因对卵巢癌细胞SKOV‑3生殖发育的影响，SPAG6可以作为早期诊断卵巢肿瘤的指标。本发明专利技术通过SPAG6在卵巢表皮肿瘤的试验，为卵巢肿瘤等诊断和治疗提供新的靶点，用于指导新药的研发，以提高肿瘤患者的治愈率和生存率。

Use of SPAG6 gene as a marker for diagnosis and treatment of ovarian tumors

The present invention relates to the application of SPAG6 gene in the diagnosis and treatment of ovarian tumors. The invention uses QPCR and Western blot method to prove the existence of differences in expression of SPAG6 gene in ovarian tumor tissues and normal tissues, growth curve, growth inhibitory effect of paclitaxel on ovarian cancer cell SKOV 3 reproductive development test for the detection of SPAG6 gene in vitro, SPAG6 can be used as indicators of early diagnosis of ovarian cancer. The present invention provides a new target for the diagnosis and treatment of ovarian tumors by SPAG6, which is used to guide the development of new drugs to improve the cure rate and survival rate of patients with ovarian cancer.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体地涉及SPAG6基因在卵巢肿瘤的诊断、治疗中的用途。
技术介绍
微管是真核细胞普遍存在的一种纤维结构，由微管蛋白和少量微管结合蛋白的聚合作用形成，是细胞骨架的主要成分之一。微管在体内起十分重要的作用，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质的运输、真核细胞的有丝分裂过程及细胞信号传递等。细胞内，微管以胞质微管和纺锤体微管两种形式存在，这两种微管在不同细胞周期处于动态的组装和去组装状态的动态平衡中，任何使这种平衡失衡的因素均可破坏微管结构，以致影响细胞功能。肿瘤细胞具有快速增殖能力，其有丝分裂过程频繁且细胞周期明显短于正常细胞。因此，若破坏上述的动态循环，必将影响到肿瘤细胞的有丝分裂过程，使其生长受到抑制或者诱导肿瘤细胞的凋亡，因此微管是肿瘤治疗最好的靶点。根据破坏微管蛋白/微管循环的机制，药物对微管的作用可分为两类：促进微管蛋白聚合并稳定已形成的微管(抑制微管解聚)和抑制微管蛋白的聚合。前者可聚集微管蛋白而稳定微管蛋白复合物，后者抑制微管蛋白聚合而解离微管。微管稳定药物在微管蛋白上的结合腔靠近异二聚体和原丝间的重要作用区域，因而在药物与微管蛋白结合的同时也加强了异二聚体和原丝间的结合，结果促进了微管蛋白的聚合又能稳定已形成的微管，使细胞分裂停止于C2/M期。此类药物有紫杉醇类等。后者则可抑制微管蛋白聚合成微管，或解聚已聚合的微管。目前，微管结合类药物，如紫杉醇类等已在卵巢癌肿瘤治疗中发挥重要作用，但是，由于药物耐受及副作用，如过敏反应，骨髓抑制，心脑血管系统病变，恶心、呕吐，关节疼痛和脱发等，限制了这些药物发挥更大作用。因此，探索新的配方以及寻找新的微管结合靶蛋白显得尤为重要。卵巢肿瘤早期病变不典型，容易忽视或者治疗不当延误病情，临床上确诊时多已为晚期的患者。因此寻找适用于恶性肿瘤的早期诊断、评估肿瘤预后的分子生物标记物成为了研究的热点。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种用于卵巢肿瘤早期诊断的分子标志物。首选，需要说明的是，本专利技术是基于下列研究、探索才意外发现的。目前研究表明精子相关抗原(SPAG)在卵巢肿瘤中高表达，并且SPAG6的表达受其启动子甲基化水平的调节，SPAG6基因沉默明显抑制卵巢癌细胞生长，抑制该基因后对肿瘤细胞生物特性的影响。这些研究结果表明SPAG6可能是一个新的卵巢肿瘤诊断和治疗的靶蛋白，因而具有巨大的应用价值。为研究SPAG6基因是否在卵巢表皮肿瘤组织表达增加，专利技术人取40例卵巢癌患者标本和40例癌旁组织对照标本，用免疫组织化学方法在显微镜下观察到卵巢癌中SPAG6表达水平明显高于癌旁组织。用焦磷酸盐测序法检测SPAG6基因启动子甲基化，检测了SPAG6启动子区域13个位点76个“CpG”岛甲基化情况，发现15个异常甲基化“CpG”岛，其中4个高甲基化，11个低甲基化。我们应用实时定量PCR和westernblot检测了正常人卵巢上皮细胞和SKOV-3细胞的SPAG6的mRNA和蛋白表达，结果发现，SKOV-3细胞中SPAG6的mRNA和蛋白表达水平均明显高于正常人卵巢上皮细胞。为研究去甲基化试剂5-AZA对卵巢上皮细胞SPAG6基因mRNA表达影响，专利技术人用5μm/L去甲基化试剂5-AZA处理正常人卵巢上皮细胞48小时，提取总RNA，实时定量PCR检测SPAG6基因mRNA表达水平，实验表明处理后的SPAG6mRNA表达较未处理的细胞显著增加。为了研究SPAG6基因低表达对肿瘤细胞恶性生物学性状的影响，专利技术人设计了4条靶向SPAG6的RNA干扰片段，插入到pYr-LVsh载体中。转染细胞后，提取总RNA，采用实时定量PCR方法检测SPAG6mRNA表达水平。经过筛选，专利技术人发现SPAG6-sh4序列抑制率较高，为91％。我们后来也构建了靶向SPAG6的RNA干扰慢病毒，感染细胞后，结果表明干扰效率在19％到91％之间。将shRNA4质粒转染SKOV3卵巢癌细胞，建立了SPAG6低表达细胞株，绘制细胞生长曲线，发现细胞生长速度显著降低。为了说明SPAG6基因抑制增加了肿瘤细胞对紫杉醇(Taxol)敏感性，专利技术人将SPAG6抑制细胞及对照细胞接种于24孔板中，然后用Taxol(0，1，10，50nM)处理。3天后，对活细胞计数并计算生存率。结果发现，SKOV-3细胞的SPAG6被抑制后，10nM以上剂量组的细胞生存率显著减低，表明抑制SPAG6后，肿瘤细胞对Taxol治疗的敏感性增加。因而，本专利技术的第一个方面，本专利技术提供了检测SPAG6基因表达的产品在制备诊断卵巢肿瘤的工具中的应用。根据本专利技术实施例，正常组织和卵巢肿瘤组织中SPAG6基因的表达差异。根据本专利技术实施例，SPAG6蛋白在卵巢表皮细胞肿瘤组织表达水平是：SPAG6在肿瘤组织表达水平明显高于癌旁组织。根据本专利技术实施例，正常卵巢上皮细胞和卵巢癌上皮细胞中SPAG6基因的表达差异。根据本专利技术实施例，在转录水平上检测SPAG6基因的差异表达，与正常卵巢上皮细胞相比，卵巢癌上皮细胞中SPAG6基因的mRNA表达水平明显升高。根据本专利技术实施例，在蛋白水平上检测SPAG6蛋白的差异表达，与正常卵巢上皮细胞相比，卵巢癌上皮细胞中SPAG6蛋白含量升高。根据本专利技术实施例，SPAG6基因表达抑制对肿瘤细胞恶性生物学性状的影响，包括：重组质粒GFP-Spag6L/pcDNA3-Spag6L分别转染CHO细胞/COS-7细胞；根据SPAG6mRNA序列设计四个靶序列：shRNA1，shRNA2，shRNA3和shRNA4，按照说明书操作把它们转入到PLVRNAi质粒中；转染细胞后，提取总RNA；结果：实时定量PCR检测SPAG6mRNA表达水平，SPAG6-sh4序列抑制率较高；Westernblot检测，shRNA4-spag6稳定细胞的蛋白表达明显减少。根据本专利技术实施例，SPAG6基因抑制增加了肿瘤细胞对泰素敏感性。根据本专利技术实施例，SPAG6基因在卵巢肿瘤组织中表达采用焦磷酸盐测序法，所述焦磷酸盐测序法检测SPAG6启动子CpG岛甲基化的方法如下：步骤1：甲基化修饰；步骤2：纯化亚硫酸盐修饰的DNA；步骤3：甲基化PCR；步骤4：Pyrosequencing检测。根据本专利技术实施例，SPAG6蛋白在卵巢表皮细胞肿瘤组织表达水平的检测步骤如下：步骤1：石蜡切片脱蜡至水；步骤2：3％H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；步骤3：蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min2次；步骤4：5-10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10min，去除血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1-2h；步骤5：PBS冲洗，5min3次；步骤6：滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30min；步骤7：PBS冲洗，5min3次；步骤8：滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30min步骤9：PBS冲洗，5min3次；步骤10：显色剂显色3-15min；步骤11：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。根据本专利技术实施例，在转录水平上检测SPAG6基因的差异表达的方法：步骤1：总RNA提取；本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测SPAG6基因表达的产品在制备诊断卵巢肿瘤的工具中的应用。

【技术特征摘要】
1.检测SPAG6基因表达的产品在制备诊断卵巢肿瘤的工具中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，正常组织和卵巢肿瘤组织中SPAG6基因的表达差异。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，SPAG6蛋白在卵巢表皮细胞肿瘤组织表达水平是：SPAG6在肿瘤组织表达水平明显高于癌旁组织。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，正常卵巢上皮细胞和卵巢癌上皮细胞中SPAG6基因的表达差异。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在转录水平上检测SPAG6基因的差异表达，与正常卵巢上皮细胞相比，卵巢癌上皮细胞中SPAG6基因的mRNA表达水平明显升高。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在蛋白水平上检测SPAG6蛋白的差异表达，与正常卵巢上皮细胞相比，卵巢癌上皮细胞中SPAG6蛋白含量升高。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SPAG6基因表达抑制对肿瘤细胞恶性生物学性状的影响，包括：重组质粒GFP-Spag6L/pcDNA3-Spag6L分别转染CHO细胞/COS-7细胞；根据SPAG6mRNA序列设计四个靶序列：shRNA1，shRNA2，shRNA3和shRNA4，按照说明书操作把它们转入到PLVRNAi质粒中；转染细胞后，提取总RNA；结果：实时定量PCR检测SPAG6mRNA表达水平，SPAG6-sh4序列抑制率较高；Westernblot检测，shRNA4-spag6稳定细胞的蛋白表达明显减少。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SPAG6基因抑制增加了肿瘤细胞对泰素敏感性。9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，SPAG6基因在卵巢肿瘤组织中表达采用焦磷酸盐测序法，所述焦磷酸盐测序法检测SPAG6启动子CpG岛甲基化的方法如下：步骤1：甲基化修饰；步骤2：纯化亚硫酸盐修饰的DNA；步骤3：甲基化PCR；步骤4：Pyrosequencing检测。10.权利要求3所述的应用，其特征在于，SPAG6蛋白在卵巢表皮细胞肿瘤组织表达水平的检测步骤如下：步骤1：石蜡切片脱蜡至水；步骤2：3％H...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志兵，石玉琴，张玲，柳赟昊，付国庆，江高峰，周婷，李玉红，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42