人卵巢间皮细胞及其分离和使用方法技术

本发明专利技术公开了基本纯的人卵巢间皮细胞群体，以及分离和培养卵巢间皮细胞的方法。通过小心操作卵巢间皮细胞的微环境，可以得到多次传代，其中卵巢间皮细胞能够成为卵巢表面上皮细胞或颗粒细胞。另外，本文还公开了使用人卵巢间皮细胞的几种方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于发育生物学和细胞生物学领域。具体而言，本专利技术涉及能够分化成卵巢表面上皮细胞和颗粒细胞的卵巢间皮细胞群体、分离卵巢间皮细胞的方法、卵巢间皮细胞的表征、和卵巢间皮细胞的用途。
技术介绍
卵巢癌是女性死于癌症的最常见起因之一(Boring C.C.等人，CA-Cancer J.Clin.，4119-36，1991)。在大约80-90％的卵巢癌病例中，认为卵巢表面上皮是发生癌性转化的组织源(NicosiaS.V.，《Pathology of Human Neoplasms》即人肿瘤病理学，纽约，Raven出版社，第435-486页，1988；Scully R.E.，Am.J.Pathol.，87686-720，1977)。卵巢表面上皮(OSE)是覆盖卵巢表面的细胞单层，而且在卵巢门处与体腔间皮相连(Dubeau L.等人，AnticancerResearch，101233-1240，1990)。认为OSE细胞衍生自覆盖性腺嵴的间皮细胞。间皮细胞基质化，迁移到卵巢内，并成为颗粒细胞。颗粒细胞(卵巢中的主要内分泌细胞类型之一)首先在出生前阶段作为围绕卵母细胞的单层细胞出现于原始卵泡。当每个卵泡变得活泼时，卵母细胞开始变大，而颗粒细胞开始分裂，数目增加，并分泌雌激素。当卵泡成熟时，颗粒细胞停止分裂，而卵泡在称为排卵的过程中喷出卵母细胞。排卵后，颗粒细胞就分化成分泌孕酮的发育中黄体的黄体细胞。由于缺乏人卵巢组织模型，因而难以确认卵巢表面上皮是否癌性生长的源头。另外，由于仍在改进能够分离OSE细胞并仍然保持其原始特征的培养条件，因而缺乏关于卵巢表面上皮细胞在卵子发生和卵泡形成过程中的发育的理解。能够可靠分化成多种细胞类型(诸如OSE细胞和颗粒细胞)的卵巢前身细胞的鉴定、分离、和表征对于理解卵巢细胞的生物学和为什么发生癌性转化(像卵巢癌)及(或许)如何能够预防转化可能是重要的。然而，卵巢前身细胞像许多前身细胞一样，数目较少且难以分离。一旦分离了，却难以培养卵巢前身细胞而又保持它们的前身性状。推测存在颗粒细胞和OSE细胞的前身，但是迄今完成的工作只分离得到OSE细胞和颗粒细胞，而未能分离得到这两种细胞类型的共同前身。已经有关于人OSE细胞的分离和培养方法的几份报告(Kruk P.A.等人，Laboratory Investigation，63(1)132-136，1990；SiemensC.H.和Auersperg N.，Journal of Cellular Physiology，134347-356，1988；Auersperg N.等人，In Vitro，20(10)743-755，1984)。在这些报告中，分离和培养的人OSE细胞早已处于最终分化形式。还报告了兔OSE细胞和颗粒细胞的分离和表征(Piquette G.N.和Timms B.G.，In Vitro Cell.Dev.Biol.，26471-481，1990)。然而，其中OSE细胞早已分化，因而使得对与早期OSE发育相关的事件或早期OSE发育过程中的早期癌性转化的研究工作变得困难。有些研究项目已经完成了颗粒细胞前身的鉴定。通过随机X染色体灭活技术和使用磷酸甘油酸激酶-1(PGK-1)(糖酵解酶变体)的X连锁异源酶变体，测定得知小鼠卵巢中颗粒细胞克隆前身的数目较少(大约5个)(TelferE.等人，J.Reprod.Fert.，84105-110，1988)。涉及卵巢颗粒干细胞的其它研究证明颗粒细胞而非卵母细胞是卵巢中端粒酶活性的来源，因而，正如作者所述，他们的结果支持他们的假设即颗粒细胞是由一群干细胞产生的(Lavranos T.C.等人，Biol.of Reproduction，61358-366，1999)。卵巢前身细胞研究中的一种考虑提倡使用胎儿而非成年卵巢作为细胞来源，因为胎儿中的前身细胞可能具有比成人更高的活性和更多的数目。为此，已经描述了来自称为卵巢网的卵巢区域的胎儿上皮细胞，但是并未描述这些细胞具有分化成任何其它类型的卵巢间皮细胞的多能性(Dubeau等人，Anticancer Research，101233-1240，1990)。因此，需要鉴定、分离、培养、和表征具有多能性的卵巢间皮细胞的方法。本文所述方法克服了许多上述缺点，还提供了相关优势。专利技术概述本专利技术涉及发育和细胞生物学领域。在一个方面，本专利技术涉及基本纯的人卵巢间皮细胞群体，它们具有分化成卵巢表面上皮细胞和颗粒细胞的多能性。在另一方面，本专利技术涉及分离基本纯的人卵巢间皮细胞群体的方法，它们具有分化成卵巢表面上皮细胞和颗粒细胞的多能性。在还有一个方面，本专利技术涉及维持基本纯的人卵巢间皮细胞群体的方法，它们具有分化成卵巢表面上皮细胞和颗粒细胞的多能性，以及维持或培养这些卵巢间皮细胞并使之保持多能性的方法。在还有一个方面，本专利技术涉及提供免疫原的来源的方法，以及基本纯的卵巢间皮细胞群体作为免疫原的用途。在还有一个方面，本专利技术涉及通过将基本纯的人卵巢间皮细胞群体导入非人哺乳动物受体来生成人卵巢组织模型的方法。在另一方面，本专利技术涉及提供细胞疗法的方法，即将基本纯的人卵巢间皮细胞群体导入异源受体中能够支持卵巢细胞的增殖和生长的部位。在另一方面，本专利技术涉及提供卵巢间皮组织特异性生物学成分的来源用于开发药物的方法，其中基本纯的人卵巢间皮细胞群体用作卵巢间皮细胞生物学成分的来源，而且一种或多种上述卵巢间皮生物学成分是开发中药物的作用靶。在另一方面，本专利技术涉及提供核酸或蛋白质的来源用于生物测定法开发的方法，其中基本纯的人卵巢间皮细胞群体用作核酸或蛋白质的来源，而且所述核酸或蛋白质用作生物测定法或生物测定法开发中的一种或多种主要成分。图的简述本专利的文件包括至少一幅彩图。专利和商标事务所将在收到请求和必需的费用后提供本专利及彩图的拷贝。附图说明图1A的显微照片显示了人卵巢间皮细胞自实体卵巢组织向外生长。图1B的显微照片显示了人卵巢间皮细胞作为细胞簇在悬浮培养中的生长。图1C的显微照片显示了人卵巢间皮细胞作为单层的生长。图2显示了免疫组织化学分析的结果，其中单克隆抗体5C8特异识别人胎卵巢组织中的卵巢间皮细胞。图2A显示了100x的放大倍数，图2B显示了400x的放大倍数。图3显示了卵巢间皮细胞簇的免疫过氧化物酶染色结果。图3A显示了卵巢间皮细胞关于细胞角蛋白19的染色。图3B显示了卵巢间皮细胞关于细胞角蛋白13和16的染色。图3C显示了卵巢间皮细胞关于细胞角蛋白10、11、和18的染色。图3D显示了卵巢间皮细胞关于波形蛋白的染色。图3E显示了卵巢间皮细胞关于受到单克隆抗体5C8识别的卵巢间皮细胞表面抗原的染色。图4显示了组织重组实验的结果，其中将人卵巢间皮细胞与大鼠尿殖窦间充组织重组并移植到小鼠中。图4A、4B、和4C显示了卵巢表面上皮细胞类似囊状结构的形态。图5显示了免疫组织化学分析的结果，其中能够通过抗卵巢单克隆抗体5C8特异检测(棕色，以箭头指示)卵巢癌中的癌性上皮细胞。专利技术详述为了帮助本领域技术人员实践本专利技术而提供下文详述。不应将详述解释成对本专利技术的限制，因为本领域普通技术人员可以修改本文公开的实施方案而不违背本专利技术的精神和范围。在整篇公开书中，引用了多种发表物、专利、和本文档来自技高网...

【技术保护点】
基本纯的人卵巢间皮细胞群体，其中所述卵巢间皮细胞具有分化成卵巢表面上皮细胞或颗粒细胞的多能性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李荣皓，L鲍尔德，JP玛瑟，
申请(专利权)人：雷文生物技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]