CMPK的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及CMPK的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。本发明专利技术运用siRNA与shRNA技术敲低卵巢癌细胞株中CMPK表达后，卵巢癌细胞出现生物学功能改变：细胞增殖下降，凋亡率增加；侵袭与迁移能力下降，且敲降作用十分显著。因此可设计合成针对CMPK靶基因的药物用于治疗卵巢癌，本发明专利技术为临床治疗卵巢癌提供了新的思路，为研究卵巢癌的基因治疗提供了新的方向。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和医药
，具体地说，涉及CMPK的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
技术介绍
卵巢癌为女性生殖系统肿瘤中死亡率最高的肿瘤，早期症状隐蔽，在临床一经诊断，绝大多数处于晚期，预后差。现有治疗方法主要为化疗加手术。化疗副反应较多，手术后遗症风险较大。因此，寻找可早期诊断卵巢癌的生物标志物，和研发副反应少的新药物对于卵巢癌的治疗来说意义重大。胞苷酸激酶(Cytidinemonophosphatekinase，CMPK)是核苷酸激酶家族成员之一，在核苷代谢的生物合成、DNA损伤修复、肿瘤发生中起着重要的作用。目前研究发现，CMPK表达水平的高低对乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胶质瘤等肿瘤药物治疗敏感性和生存期方面有重要作用(Liu,N.-2016；Ohmine,K.-2015；Ryu,J.-2011)。然而关于CMPK在卵巢癌增殖、转移、侵袭、凋亡等方面的生物学研究尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供CMPK的抑制剂的一种新用途。第一方面，提供了CMPK的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。第二方面，提供了CMPK的抑制剂在制备试剂中的应用，所述的试剂用于：a)抑制卵巢癌细胞增殖、迁移或侵袭；b)促进卵巢癌细胞凋亡；或c)阻滞卵巢癌细胞的细胞周期。作为一种具体实施方式，所述的抑制剂选自以CMPK蛋白或它们的转录本为靶序列、且能够抑制其蛋白表达或基因转录的siRNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。作为一种具体实施方式，所述的shRNA编码序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。作为一种具体实施方式，所述的siRNA序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。第三方面，提供了一种治疗卵巢癌的shRNA分子，所述的siRNA分子编码序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。第四方面，提供了一种治疗卵巢癌的siRNA分子，所述的siRNA分子序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本专利技术优点在于：本专利技术运用siRNA与shRNA技术敲低卵巢癌细胞株中CMPK表达后，卵巢癌细胞出现生物学功能改变：细胞增殖下降，凋亡率增加；侵袭与迁移能力下降，且敲降作用十分显著。因此可设计合成针对CMPK靶基因的药物用于治疗卵巢癌，本专利技术为临床治疗卵巢癌提供了新的思路，为研究卵巢癌的基因治疗提供了新的方向。附图说明图1：A、B：敲低CMPK后，相比NC-siR(NegativeControl-siRNA)组，OVCAR-3与SK-OV-3细胞增殖能力明显受抑制；C、E：用siRNA转染卵巢癌细胞株OVCAR-3后CMPK的敲低效果判断(CMPK-siR)；D、F：用siRNA转染卵巢癌细胞株SK-OV-3后CMPK的敲低效果(CMPK-siR)。实验均重复三次。*P<0.05，**P<0.01。图2：A：用CMPK-shRNA敲低CMPK后，细胞3D微组织生长变慢，体积变小；B：3D微组织培养15天后，生长曲线分析显示，相比NC(NegativeControl)组，CMPK-shRNA3D微组织直径小于NC组。实验均重复三次。*P<0.05。图3：A、B：迁移实验发现，用siRNA敲低卵巢癌细胞CMPK后，迁移能力下降；C、D：侵袭实验发现，相比NC组，CMPK-shRNA组侵袭能力下降；E、F、G：用shRNA敲低CMPK后，转移侵袭相关蛋白MMP-9与MMP-2表达下降。实验均重复三次。*P<0.05，**P<0.01。图4：A、B：相比NC组，卵巢癌细胞出现G2/M期阻滞；C-F：shRNA敲低CMPK效果分析(CMPK-shRNA)；G-J：敲低卵巢癌细胞CMPK后，增殖核抗原PCNA表达下调。实验均重复三次。*P<0.05，**P<0.01。图5：A、B：相比NC组，敲低CMPK组卵巢癌细胞凋亡率增加；C、D：shRNA敲低CMPK后active-caspase-3表达上调。实验均重复三次。*P<0.05，**P<0.01。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。如本文所用，所述的“CMPK抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调CMPK的表达水平。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是抑制CMPK表达的病毒产品。所述的CMPK抑制剂是指任何可降低CMPK的活性、降低CMPK的稳定性、下调CMPK的表达、减少CMPK有效作用时间的物质，这些物质均可用于本专利技术，作为对于下调CMPK有用的物质。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调CMPK的表达。实施例1一、实验方法1CMPK对卵巢癌细胞增殖的影响a)选用卵巢癌细胞株OVCAR-3和SK-OV-3，用携带抗puromycin基因的shRNA+GFP敲低CMPK，采用puromycin进行筛选，构建稳转细胞株CMPK-shRNA-OVCAR-3和CMPK-shRNA-SK-OV-3。CMPK-shRNA编码序列：CMPK-homo-422Sense：5’-gatccGAAAGATTGTACCAGTTGATTCAAGAGATCAACTGGTACAATCTTTCTTTTTTg-3’(SEQIDNO.1)，Antisense：5’-aattcAAAAAAGAAAGATTGTACCAGTTGATCTCTTGAATCAACTGGTACAATCTTTCg-3’(SEQIDNO.2)。按MOI＝20(OVCAR-3/SK-OV-3)加入CMPK-shRNA病毒颗粒建立稳转细胞株；对照组空转等量慢病毒颗粒(NC)。经蛋白印迹法验证敲除效率。b)WST-1法：OVCAR-3(4000cells/孔)和SK-OV-3(3000cells/孔)在96孔板内孵育24h，分为Blank组、Reagent组、NC-siRNA组、CMPK-siRNA组。转染试剂X-Gene：siRNA＝6:1(V/M)，X-Gene与siRNA(CMPK-homo-422Sense：5’-GAAAGAUUGUACCAGUUGA-3’(SEQIDNO.3)，3’端加TT，Antisense：5’-UCAACUGGUACAAUCUUUC-3’(SEQIDNO.4)，3’端加TT)分别用Opti-MEM15μl稀释，5min内混合，静置15min后，加入到用无血清培养基Opti-MEM(GIBCO)培养5h后换成新鲜完全培养基置CO2培养箱中培养。NegativeControl组加入与siRNA等量的NC(Sense：5’-GCGACGAUCUGCCUAAGAU-3’(SEQIDNO.5)，3’端加TT；Antisense：5’-AUCUUAGGCAGAUCGUCGC-3’(SEQIDNO.6)，3’端加TT)。Blank组、Reagent组分别加等量Opti-MEM、转染试剂，24h、48h、72h后在OD450nm测吸光度。各时本文档来自技高网...

【技术保护点】
CMPK的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.CMPK的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。2.CMPK的抑制剂在制备试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂用于：a)抑制卵巢癌细胞增殖、迁移或侵袭；b)促进卵巢癌细胞凋亡；或c)阻滞卵巢癌细胞的细胞周期。3.根据权利要求1或2所述的应用，所述的抑制剂选自以CMPK蛋白或它们的转录本为靶序列、且能够抑制其蛋白表达或基因转录的siRNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国雄，周代兵，
申请(专利权)人：复旦大学附属金山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31