The invention discloses a method for rapidly screening the topoisomerase I inhibitor in natural products. The method is: the preparation of reaction buffer with the enzyme preparation; the sample; the preparation of standard solution; the sample with normal and inactivation of topoisomerase I binding reaction; chromatographic analysis of the reaction mass spectrometric detection of samples; the enrichment rate of topoisomerase I inhibitors. The invention of ultrafiltration technique and chromatography, mass spectrometry hyphenated method is applied to the screening of topoisomerase I inhibitors, sample analysis speed, strong specificity, can easily identify the drug ligand combined with biological target molecules; and the sample analysis of less amount and spectrum of a large amount of information, can achieve rapid screening the compounds, it has great advantages in the study of drug molecules and biological macromolecules ligand receptor interaction; suitable for the analysis of natural product extracts or compounds of topoisomerase I in vitro enrichment rate.
【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及天然产物分析领域,尤其涉及一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法;具体地说,本专利技术是利用超滤膜技术与色谱、质谱联用技术从天然产物提取物或其单体化合物中快速筛选拓扑异构酶I抑制剂的方法。
技术介绍
DNA拓扑异构酶I,是广泛存在于原核和真核生物体内的一种必需酶,其催化部位的酪氨酰残基攻击DNA单链,使得酶与DNA3'-磷酸二脂键形成共价连接,造成DNA单链的断裂,从而通过调节超螺旋、连锁、去连锁以及核酸解结作用,影响DNA拓扑结构。靶向药物是目前应用于癌症治疗的最先进的药物,它通过与肿瘤发生、生长所必需的特定靶点作用来阻止肿瘤细胞的生长。研究发现,拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达,特别是结肠癌、宫颈癌和卵巢癌等的拓扑异构酶I含量及活性远高于正常体细胞,尤其在S期肿瘤细胞中活性大幅提高。因此,拓扑异构酶I抑制剂可选择性地抑制增殖期肿瘤细胞DNA复制,阻止肿瘤细胞快速增殖,进而杀死肿瘤细胞。由于拓扑异构酶I抑制剂具有众多优越性,美国国家癌症研究所药物机制分析电脑网络系统已将拓扑异构酶I抑制剂列为重点研究的六大类抗肿瘤药物之一,该酶已成为设计新型抗癌药物的重要新靶点,对其抑制剂的研究可为肿瘤的治疗提供新的临床药物和技术手段。拓扑异构酶I抑制剂的常规筛选法一般使用光谱法、表面等离子共振法、X射线散色法、量热法和核磁共振法等(ChenxiYao,NaNa,LingyunHuang,DachengHe,JinOuyang.AnalyticaChimicaActa,2013,79,60 ...
【技术保护点】
一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法,其特征在于包括以下步骤:所述的超滤质谱联用技术是指一种将超滤膜技术与色谱、质谱分析方法联合使用所形成的一种新的研究手段;所述的拓扑异构酶I抑制剂是天然产物提取物或其单体化合物;本专利技术优选天然产物鼠李提取物、石蒜生物碱提取物、单体化合物重楼皂苷I、II、VI和VII;①酶结合反应缓冲液的配制(1)酶结合反应缓冲液包括:醋酸钾:50 毫摩尔/升,三羟甲基氨基甲烷‑醋酸:20毫摩尔/升,醋酸镁:10毫摩尔/升,二硫苏糖醇:1毫摩尔/升;精确称取醋酸钾4907毫克、三羟甲基氨基甲烷‑醋酸2422.8毫克、醋酸镁2144.6毫克和二硫苏糖醇154.3毫克,使用去离子水溶解至终体积为1升,充分混合后,25℃下pH值为7.9;②待测样品的配制(2)精确称取适量待测样品,用酶结合反应缓冲液充分溶解,待测液终浓度为1.0‑3.0毫克/毫升;所述的待测样品是鼠李提取物或石蒜生物碱提取物;③标准溶液的配制(3)用乙腈将内标样品配制成浓度为100微克/毫升的标准母液,进行质谱检测前加入至待测样品液中,终浓度为2.0‑5.0微克/毫升;所述的标准品为异夏佛塔苷 ...
【技术特征摘要】
1.一种快速筛选天然产物中拓扑异构酶I抑制剂的方法,其特征在于包括以下步骤:
所述的超滤质谱联用技术是指一种将超滤膜技术与色谱、质谱分析方法联合使用所形成的一种新的研究手段;
所述的拓扑异构酶I抑制剂是天然产物提取物或其单体化合物;本发明优选天然产物鼠李提取物、石蒜生物碱提取物、单体化合物重楼皂苷I、II、VI和VII;
①酶结合反应缓冲液的配制(1)
酶结合反应缓冲液包括:
醋酸钾:50毫摩尔/升,三羟甲基氨基甲烷-醋酸:20毫摩尔/升,
醋酸镁:10毫摩尔/升,二硫苏糖醇:1毫摩尔/升;
精确称取醋酸钾4907毫克、三羟甲基氨基甲烷-醋酸2422.8毫克、醋酸镁2144.6毫克和二硫苏糖醇154.3毫克,使用去离子水溶解至终体积为1升,充分混合后,25℃下pH值为7.9;
②待测样品的配制(2)
精确称取适量待测样品,用酶结合反应缓冲液充分溶解,待测液终浓度为1.0-3.0毫克/毫升;
所述的待测样品是鼠李提取物或石蒜生物碱提取物;
③标准溶液的配制(3)
用乙腈将内标样品配制成浓度为100微克/毫升的标准母液,进行质谱检测前加入至待测样品液中,终浓度为2.0-5.0微克/毫升;
所述的标准品为异夏佛塔苷或荷叶碱;
④待测样品与正常和失活拓扑异构酶I的结合反应(4)
实验组:在0.2毫升的离心管中依次加入100微升的待测样品液与10微升浓度为0.5U/微升的DNA拓扑异构酶I,37℃下孵育30分钟;将反应混合液转移至截留分子质量为3万道尔顿的超滤管中,在10000转/分钟下离心10分钟;加入200微升缓冲液洗去未结合成分,并再次在10000转/分钟下离心10分钟;重复上述步骤2次,合并滤液;向超滤管中加入200微升的90%乙腈,室温下放置...
【专利技术属性】
技术研发人员:郭明全,陈桂林,田永强,张春云,
申请(专利权)人:中国科学院武汉植物园,
类型:发明
国别省市:湖北;42
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