本发明专利技术提供一种MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1细胞系及其构建方法，具体涉及将编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和将编码β1-4GalT1基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1基因的MDCK细胞系MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1，该细胞系可用于禽流感病毒疫苗株的大规模细胞化培养和生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及工程细 胞系MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl及其构建方法，所构建细胞系可用于禽流感疫苗株的大規模细胞化生产。
技术介绍
流感病毒表面的血凝素(HA)通过与宿主细胞表面的唾液酸寡糖受体结合从而起始病毒感染宿主细胞，禽源和马源流感病毒偏嗜结合α 2，3-唾液酸寡糖受体(Neu5Aca2，3Gal)，而人源和猪源流感病毒偏嗜结合α2，6_唾液酸寡糖受体(Neu5Ac α 2，6Gal)。因此，细胞表面唾液酸受体的类型及丰度，影响流感病毒对不同宿主的适应性。不同的唾液酸受体对流感病毒在宿主细胞中感染、复制和扩散产生重要的影响。目前获得批准生产的是鸡胚来源的灭活疫苗。哺乳动物细胞生产的疫苗在动物模型中表现出较好的保护性作用，当前Madin-Darby犬肾上皮细胞系(MDCK)被认为是培养A型和B型流感病毒最适合的细胞系。传统的流感病毒疫苗是依靠鸡胚生产的，病毒经过培养增殖、浓缩、灭活、进一歩纯化，配制、无菌灌装，最后检测和放行。除了研发使用高产重组毒株作为A型流感的种毒，基本生产エ艺在过去的60年几乎没什么变化。不仅成本代价高，而且鸡胚的残留物质还可能引起过敏反应，此外，当面临高致病流感病毒导致的全球大流行时，传统的鸡胚生产方法可能不足以满足全球疫苗市场的需求。因此，研究机构和疫苗公司正在合作开发新的生产技木，以达到省时高效的目的。为了获得流感疫苗生产的替代方法，疫苗公司已经尝试了许多新的途径。组织培养的细胞系作为鸡胚生产方式的一种补充或替代方法，已经引起了人们的重视。细胞生产系统主要具有以下优势1)可以应用许多在鸡胚生产系统中得到临床验证的基本方法(如全病毒的生产、多步裂解、纯度更高的流感抗原或减毒活疫苗)，同时，缩短鸡胚生产的供应时间，稳定产品供应链；2)可以应用更加先进可控的种毒生产系统，由于生产用细胞特征的高度一致性，降低了引入外源性污染的风险；3)提供了一种更加高效、稳定、可重复的疫苗生产方式，使用一种规格可变且封闭的生物反应器，可以在任意时间起始反应，并可以根据需要延长生产周期；4)提高了部分禽流感毒株生产疫苗的能力。除了上述优点，以哺乳动物细胞生产疫苗至少具有一种理论上的优点在鸡胚中进行的流感病毒的分离和复制通常会产生特定表型的选择，而这种选择往往不同于正确的人类分离株。相反，在细胞中进行的流感病毒的分离复制不会产生这种传代依赖性的表型选择。从而有利于表达天然构象的血凝素抗原，优化抗体的特异性。Madin-Darby犬肾上皮细胞系(MDCK)来源于ー只成年猎犬的肾脏组织。关于MDCK细胞来源的季节性流感疫苗的临床试验结果表明，MDCK细胞来源的病毒经过连续传代之后，可以保持抗原的稳定性，此类疫苗的安全性和免疫原性与鸡胚来源的疫苗相当。人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸转移酶IV (hST3GalIV)能将唾液酸(Neu5Ac)转移到糖蛋白的末端的2型糖链(Gal β l-4GlcNAc)，或者I型糖链(Gal β l_3GlcNAc)上的半乳糖(Gal)，Neu5Ac和末端的Gal之间连键是α 2-3。hST3GalIV优先作用于2型糖链(Gal β l_4GlcNAc)，其次才是 I 型糖链(Gal β l_3GlcNAc)。人源β 1-4半乳糖基转移酶I (UDP-半乳糖Ν-こ酰氨基葡萄糖基β 1-4半乳糖基转移酶，简称为β l_4GalTl，EC2.4. I. 38)，是ー组II型膜结合糖蛋白，能把半乳糖基(Gal)转移到糖链的N-こ酰葡萄糖(GlcNAc)上，Gal与GIcNAc之间的连键是β 1-4。
技术实现思路
本研究首次建立了提高禽流感病毒α 2，3-唾液酸丰度的MDCK细胞系一MDCK-hST3GalIV-P4GalTl 细胞。通过稳定共表达 hST3GalIV 和 β l_4GalTl，可以增强β l-4GalTl催化半乳糖与N-こ酰葡萄糖以β 1-4连键连接的效力，hST3GalIV催化唾液酸与半乳糖以α 2-3连键连接的效力，从而提高MDCK细胞表面α2，3_唾液酸丰度。该稳定表达细胞系细胞表面α 2，3-唾液酸显著高于母本MDCK细胞系，与母本MDCK细胞系相比，禽流感病毒的分离株和疫苗候选株在MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系上形成更大的 噬斑，生长滴度更高。稳定共表达hST3GalIV和β l_4GalTl的MDCK细胞系建立之后，更适合禽流感病毒的生长，无论是病毒滴度还是噬斑形成能力都要更高，也证明了禽流感病毒对α 2，3-唾液酸的偏嗜性，不仅为研究α 2，3-唾液酸受体提供了方便的工具，对于实时监测禽流感病毒进行受体结合特性、检测禽流感病毒变异株的出现、发现受体结合特性发生变化的禽流感毒株具有广泛的应用价值。此外，MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系在抗禽流感病毒药物、疫苗株筛选以及细胞培养疫苗的生产方面都展示出较好的应用前景。本专利技术稳定表达人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)和β 1-4半乳糖转移酶(β l-4GalTl)的MDCK细胞系，是MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl ;保藏号为CGMCC No. 5967。所述的 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞系同时含有编码 hST3GalIV 的基因和编码β l_4GalTl的基因。所述编码hST3GalIV的基因序列如SEQ ID No:l所显示，其所编码的hST3GalIV的氨基酸序列如SEQ ID No:3所显示；所述编码β l_4GalTl的基因序列如SEQ ID No:2所显示，其所编码的β l_4GalTl的氨基酸序列如SEQ ID No:4所显示。所述编码hST3GalIV基因序列和β l_4GalTl基因序列来自于人。本专利技术的另ー个方面，提供构建MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系的方法，所述方法包括将hST3GalIV和β l_4GalTl的基因重组到MDCK细胞的基因组中。所述MDCK-hST3Gal IV-MGalTl细胞系的构建方法，是将带有编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和带有编码β l_4GalTl基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β l_4GalTl基因的细胞系MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl。在本专利技术的另ー个方面中，提供ー种提高禽流感病毒生长滴度的方法，该方法包括，将H5N1亚型或H9N2亚型禽流感病毒株接种于本专利技术构建的MDCK-hST3GalIV-^4GalTl细胞系中，病毒在所述细胞系上的培养条件为35°C、5%C02。毒株在MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系中生长滴度的提高，为禽流感疫苗的细胞化生产提供了有利条件。更具体地说，在本专利技术的一个实施方案中，将编码hST3GalIV基因的真核表达载体和β l_4GalTl基因的真核表达载体转染到MDCK细胞系中，构建稳定共表达hST3GalIV和 β l-4GalTl 的MDCK细胞系，本专利技术中一株表达hST3GalIV和 β l_4GalTl 的Madin-Darby犬肾细胞系MDC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稳定表达hST3GalIV和β1？4GalT1的MDCK细胞系，是MDCK？hST3GalIV？β4GalT1，其含有hST3GalIV和β1？4GalT1基因序列；所述hST3GalIV的基因序列如SEQ？ID？No:？1所示，所述β1？4GalT1的基因序列如SEQ？ID？No:？3所示；所述细胞系的保藏号是CGMCC？No.？5967。
【技术特征摘要】
2012.07.12 CN 201210240483.31.一种稳定表达hST3GalIV和β l_4GalTl的MDCK细胞系，是MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl，其含有 hST3GalIV 和 β l_4GalTl 基因序列；所述hST3GalIV 的基因序列如SEQ ID No: I所示,所述β l-4GalTl的基因序列如SEQ ID No: 3所示；所述细胞系的保藏号是CGMCC No. 5967。2.权利要求I所述的稳定表达hST3GalIV和βl_4GalTl的MDCK细胞系的构建方法，其特征在于，是将带有编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和带有编码β l_4GalTl基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β l_4GalTl基因的细胞系 MDCK-hST3GalIV- β 4GalTl。3.根据权利要求2所述MDCK-hST3GalIV-04GalTl细胞系的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤 1)MDCK细胞的转染及抗性细胞克隆的筛选 转染MDCK细胞密度在6孔板至80% 90%密度时用于转染；将编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和编码β l-4GalTl基因序列的真核表达质粒各I μ g质粒于100 μ L无血清Opti-MEM培养基中，混匀后添加5 μ L FuGENEeHD转染试剂，充分混匀之后室温孵育15分；将上述复合物覆盖于细胞表面，补加无血清Opti-MEM培养基至总体积为2 mL，置于37°C、5% CO2培养箱中培养24小时后移除培养物，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养； 抗性细胞克隆的筛选转染后36小时后用胰酶消化细胞，按1:10的比例传代至48孔细胞板中，继续...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀梵，孙庆，张文俊，王晓泉，胡顺林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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