产生单克隆植物细胞系的方法技术

本发明专利技术提供一种由植物细胞的异种群体产生单克隆植物细胞系的方法，其包含下列步骤：（a）提供植物细胞的异种群体；（b）由该植物细胞的异种群体制备原生质体；（c）通过将原生质体制备物进行流式细胞分选而分离单一原生质体；（d）在饲养细胞材料存在的情况下，通过共培养使分离的单一转化原生质体再生直到形成小集落；（e）将小集落从饲养细胞材料中转移，并培养小集落直到形成单克隆植物细胞系。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生单克隆植物细胞系的方法
本专利技术涉及植物生物
具体而言，本专利技术涉及通过流式细胞分选由植物细胞的异质性群体产生天然（野生型）或转基因单克隆植物细胞系。对于本领域技术人员而言明显的是，本专利技术也包含使用该单克隆植物细胞系再生整株可育性植株。
技术介绍
在过去数十年间，已将许多工作投注于建立并培养以植物为基础的系统，以用于积聚和获取天然或异种蛋白质与次级代谢产物。文献提供了大量的证据性材料来证明以植物为基础的系统的实用性，即、生产多种所希望的物质，该物质被分泌至培养基或从生产细胞、组织、细胞器或甚至于整株植物或其部分分离。同样地，存在有广泛的确保建立稳定或暂时转化的植物材料的转化实验报告（transformationprotocol）。但是，还需要可靠、相对低成本并且快速的技术，以从植物细胞获得高产量的所要产物。已重复报导，植物细胞群（诸如植物悬浮培养物）的转化通常会产生转基因培养物，该培养物显示细胞具有高度异质性（混合型）与目标蛋白质表达水平不一致，所述目标蛋白质与初级异质性细胞群中的表观基因不同的细胞混合物有关。在重组细胞系中，转基因表达的异质性证实生产率方面的严重问题。主要问题为在转化试验中通常罕见高产克隆，而且要建立同源性高产细胞系相当耗时。因此，仍存在着的技术挑战为从刚转化或已转化的转基因植物培养物中生产与回收优异的转基因产物。关于流式细胞分选（flowcytometricsorting）（诸如FACS（荧光激活细胞分选）应用），必须通过细胞的酶消化而释放出原生质体，从而自通常聚集在一起的植物细胞群或培养物取得单一球形细胞。但是，对于大部分的植物品种来说，单一原生质体的再生会受限于必须维持某一群体密度。迄今，并未描述过一种用于再生单一转基因细胞/原生质体或用于自其（特别是在流式细胞分选之后）再生完整可育性植株的可靠且可再现的工序。
技术实现思路
因此，本专利技术主要是涉及提供一种以植物为基础的系统，其利用由植物细胞的异质性（混合型）群体（诸如悬浮培养物）产生的未转化或转基因的单克隆植物细胞系，以产生高水平的所期望的天然或重组产物，并且克服现有技术的问题，尤其是关于快速分离以及接下来再生单一（转基因）原生质体，直到形成可用来建立单克隆植物细胞系的小集落（microcolony），所述单克隆植物细胞系优选能够生产并积聚大量的期望产物。对于本领域技术人员而言清楚的是，本专利技术同样提供由已建立的单克隆植物细胞系再生而来的完整可育性植株。相对于许多目前使用及开发的基于使用完整植株或至少完整并已分化的植物组织的系统，使用悬浮细胞的优势在于，同源性材料在受控、无菌与所限制的条件下可再现地生产。在植物中，目前有两种主要的生产重组蛋白质的策略，即：（i）产生稳定的转基因植物或悬浮细胞系；或（ii）在用细菌（例如土壤杆菌）、病毒（例如烟草镶嵌病毒、马铃薯病毒X/Y、豇豆花叶病毒与许多其他病毒）或两者组合（例如优化的侵染（magnifection））侵染植物表达宿主（植物、组织或细胞），使得宿主能够表达异种遗传信息（DNA或RNA）后，异质性基因瞬时表达。另外且为本领域技术人员所公知，基因信息亦可通过已建立的机械方法（例如电穿孔或激光打孔）而引入植物表达宿主。尽管本专利技术优选涉及被稳定转化的植物细胞材料的应用，但是本专利技术方法中也可以涉及用于瞬时表达的系统，其具有快速优势（基因产物、上市时间、紧急反应）以及达到比稳定转化的转基因植物或其部分（诸如细胞）高得多的积聚水平的可能性。依据本专利技术，提供一种由植物细胞的异质性群体产生天然（野生型、非转化）或转基因单克隆植物细胞系的方法。该方法包括：首先提供该植物细胞群，例如形成源植物细胞（sourceplantcell）材料的植物悬浮细胞，所述源植物细胞材料可进行如本专利技术的方法所包括的后续步骤。通常，此植物细胞材料可容易地来源于例如异质性植物悬浮培养物，该培养物优选在受控及/或无菌条件下培养。源细胞可以是（稳定地/瞬时地）转化的转基因细胞或野生型（天然、未经转化）细胞，其能够生产并积聚期望产物。由于本专利技术方法使用流式细胞分选（诸如FACS技术）来分离或离析单一的、即个体化的原生质体，这些原生质体必须使用本领域已知的材料与方法由上面提供的植物细胞群制备。依据优选实施例，这些原生质体经转化且能够：（i）生产荧光标记蛋白质或多肽；（ii）生产期望产物；以及/或者（iii）在筛选剂存在的情况下存活。流式细胞分选的优选分选标准是作为如定性特征（例如细胞凋亡）的标记的细胞颗粒度与细胞大小。FACS的优选分选标准可以选自包含遗传背景（例如倍性、非整倍性）、突变转基因（mutantstransgenics）、基因互换产物（geneexchangeproducts）与荧光（例如自发荧光（叶绿体、代谢物）、荧光蛋白质或酶介导的荧光）的组。应了解，使用筛选剂不是必需的。因此，原生质体不是必需地被赋予适当抗性的核酸序列转化。在利用流式细胞分选（诸如FACS）分离或离析单（转化）原生质体后，通过在饲养细胞材料存在情况下进行共培养，从而再生各个单一的被转化的原生质体，直到形成小集落（小愈伤组织）。植物源的来源并未受到限制，但局限于原生质体具有再生直到形成小集落或小愈伤组织的潜力的细胞系、植物品种与物种。因此，本专利技术可应用于所有再生体系（regenerationprotocol）已建立或将在未来提供的植物品种与物种。关于本专利技术涉及的将单克隆小集落或植物细胞系进一步再生为完整可育性植株的特征，应了解此特征可在所有再生系统已建立或将在未来提供的植物品种与物种中进行。之后，从饲养细胞材料中分离或转移小集落，并对该小集落进行培养，直到形成单克隆植物细胞系。依据优选实施例，本专利技术方法所包括的下一个步骤关于通过如下步骤产生单克隆愈伤组织：（i）将小集落或小愈伤组织转移至固体培育培养基；以及（ii）在至少一筛选剂存在情况下培养小集落或小愈伤组织直到形成转基因愈伤组织，通过将愈伤组织转移至液体培养基，能够由该转基因愈伤组织建立转基因单克隆植物细胞系。如本领域本领域技术人员所知，小集落亦可通过机械方法（诸如通过克隆挑取）从饲养细胞材料转移或分离。在此情况下，不需要筛选剂且由小集落所包含的细胞不需要显示出对任何筛选剂的抗性。依据优选实施例，植物细胞的异质性群体所包含的细胞是天然（例如野生型）或非转基因细胞，这些细胞在进行流式细胞分选之前被至少一种含有至少一个异种核酸序列（可操作地连接至功能性启动子）的表达载体稳定地或瞬时地进行转化，其中该至少一个异种核酸序列编码期望产物。依据进一步的实施例，该至少一种表达载体含有可操作地连接至一个或多个功能性启动子的至少两个异种核酸序列，其中该至少两个异种核酸序列编码荧光标记蛋白质或多肽以及对筛选剂的抗性或期望产物。若需要的话，上述细胞还可包含编码如本专利技术所提供的转基因单克隆植物细胞系中积聚的期望产物的异种核酸序列。这里使用的术语“异种”表示，所述的基因/核苷酸序列已通过使用基因工程（亦即通过人为干预）引入植物细胞。为实现本专利技术的目的，核苷酸的异种序列可包括由融合伴侣（fusionpartner）所组成的融合蛋白的编码序列，该融合蛋白例如可部分地由可融合至非植物蛋白的植物蛋白形成，所述融本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由植物细胞的异种群体产生单克隆植物细胞系的方法，其包含下列步骤：（a）提供植物细胞的异种群体；（b）由该植物细胞的异种群体制备原生质体；（c）通过将原生质体制备物进行流式细胞分选而分离单一原生质体；（d）在饲养细胞材料存在的情况下，通过共培养对被分离的单一转化原生质体进行再生，直到形成小集落；以及（e）将小集落从饲养细胞材料中转移，并培养小集落直到形成单克隆植物细胞系。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种由植物细胞的异质性群体产生单克隆植物细胞系的方法，其包含下列步骤：(a)提供植物细胞的异质性群体；(b)由该植物细胞的异质性群体制备原生质体并开始再生细胞壁；(c)提供细胞沉积装置，其包括在液体培养基中的饲养细胞材料；(d)通过将原生质体制备物进行FACS而分离单一原生质体；(e)将单一原生质体分选入所述包括饲养细胞材料的细胞沉积装置的液体培养基中；(f)在所述饲养细胞材料存在的情况下，通过共培养对被分离的单一原生质体进行再生，直到形成小集落...

【专利技术属性】
技术研发人员：珍娜·基尔霍夫，史蒂芬·雪勒伯格，安德烈斯·席尔迈尔，海尔格·辛克尔，莱纳·费希尔，
申请(专利权)人：弗劳恩霍夫应用研究促进协会，
类型：
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