本发明专利技术分离了一株猪伪狂犬病毒GDXX株，并以该分离株为母本，通过分子生物学手段，依次缺失胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）基因和gE基因，获得重组病毒PRV/TK－/gE－。以该重组病毒为疫苗毒株研制生产安全高效的猪用伪狂犬活疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及伪狂犬病毒
，具体地讲，涉及一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株及其制备方法，以及用含该重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的基因工程疫苗。
技术介绍
伪狂犬病毒(Psedorabiesvirus,PRV)属于抱疫病毒(Herpesviridac) α 抱疫病毒亚科(Alphaher-pesririnae)水痕病毒属(Varicello virus)的抱疫病毒 I 型(Porcineherpesvirus Typel),能引发猪的严重疾病。同时,猪既是伪狂犬病毒的忙存者，也是伪狂犬病毒的传染源，控制猪伪狂犬病不仅对养猪业本身，而且对其它动物的养殖也有着十分重要的意义。疫苗免疫接种是预防控制与消灭伪狂犬病的根本措施。 早期的猪伪狂犬疫苗主要是弱毒疫苗和灭活疫苗。早期弱毒疫苗都是通过非猪源细胞的反复传代，或鸡胚接种传代，或在某些致突变剂的存在下，在高于通常培养温度的条件下在细胞培养物上反复继代获得。目前常用的猪伪狂犬病弱毒疫苗有匈牙利Bartha-K/61株、罗马尼亚BC株、美国的BUK株和Norden株，其它如MK-21、MK-35、ALF0RT-26、NIA-4等。弱毒疫苗(天然基因缺失疫苗)虽然在伪狂犬病免疫防制方面有一定的效果，但是其毒力返强的可能性很大，并能导致疾病的流行。未经充分致弱或过度致弱的疫苗株不仅不能诱导满意的免疫保护反应，反而可能引起疾病及免疫抑制；弱毒疫苗可建立潜伏感染，并存在散毒的危险，而且部份接种猪虽然血清中存在中和抗体，但带毒期却可持续数年。灭活疫苗是将强毒株在BHK-21、IBRS-2等细胞上培养，用甲醛灭活制得，它克服了弱毒疫苗的缺点。但灭活疫苗用量大，有时导致注射部位肿胀等不良反应。此后，随着对伪狂犬病毒研究的深入，特别随着是分子生物学理论和技术的进步，从上世纪80年代初开始，世界各国相继启动了伪狂犬基因缺失疫苗的研究。伪狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特别是一些毒力基因)不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。第一代基因缺失疫苗主要是缺失TK基因。TK基因是伪狂犬病毒主要的毒力基因，其编码的胸腺嘧啶核苷激酶是核酸代谢中的重要酶类，催化脱氧胸腺嘧啶核苷的磷酸化反应，合成dTMP。虽然TK是核苷酸代谢的重要酶类，其缺失对病毒的生长有一定的影响，但并非病毒DNA复制所必需的基因。TK缺失不仅不影响病毒的免疫原性，而且还极大地降低了病毒的毒力。此外，TK缺失突变株毒力返强的可能性很低。总之，TK是伪狂犬病毒最重要的毒力基因之一，目前构建的伪狂犬病毒基因工程疫苗大多为TK缺失突变株。第一代基因缺失疫苗的代表毒株有BUK-dl3，NIA-3，ADV_783，Begonia等毒株。其中BUK-dl3是世界上第一个获得批准使用的基因工程缺失疫苗株，它是以PPV BUK株为起始材料，通过缺失TK基因序列的148bp而获得。BUK疫苗株是将其亲本病毒通过鸡胚细胞传代800代以上获得的，其US区的gE基因存在缺失。因此，BUK-dl3除了 TK基因缺失外，还有来自BUK疫苗株的gE缺失。该毒株在细胞培养物上，即使在含有HAT的选择条件下也不能回复为TK+。第二代基因缺失疫苗是在TK缺失疫苗的基础上发展起来的，如TK_/gE_，TKVgr,TK_/gG_等，它们比TK缺失的疫苗更优越。原来的TK缺失疫苗只能采用核酸杂交、限制性内切酶指纹图谱、空斑放射自显影等技术同野毒株区别。第二代基因缺失疫苗除TK缺失夕卜，在编码非必需糖蛋白的基因内引入一个新的缺失，或插入一个报告基因，这样得到的突变株不能产生缺失糖蛋白，免疫动物后不能产生相应抗体，因此可以通过血清学方法将免疫按种猪与自然感染野毒的猪相互区别。Marchioli C C等和Van Zijl M等分别构建了缺失TK和gG基因的PRV疫苗株和缺失TK和gE基因的疫苗株(783株)。Mettenleiter T C等报道，在建立表达PRV gD基因细胞系的基础上，从PRV的BamHI-7片段中缺失了 5. Ikb的片段(含有gG、gD、gE、gI基因的编码序列)，构建出了 PRV的gG_/gD7gE7gI_的四基因缺失株PRV 376株。颜其贵等构建了 PRV Fa gI_/gD_基因缺失株，小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一 定的免疫原性。周复春等构建了一系列基因缺失株(PRV Ea TK—、TK7LacZ+、TK7gG7LacZ+坐')寸/ οLiu Z等将LacZ基因表达试剂盒插入到PRV Ea株基因组的gE区，通过蓝斑筛选和纯化，得到了 TK_/gE7LacZ+PRV。利用LacZ基因处的EcoRI酶切位点来消化PRV Ea TK7gE7LacZ+基因组DNA，并与质粒pFBBS在PK-15细胞上进行共转染。经过蚀斑纯化得到了TKVgEVgDTRV0通过小鼠试验表明，此TK_/gE_/gD_PRV的毒力明显减弱。目前国内有两种猪伪狂犬基因缺失苗已获新兽药证书并投放市场，即四川农大郭万柱教授主持研发的猪伪狂犬活疫苗(S215株)和华中农业大学陈焕春教授主持研发的的猪伪狂犬活疫苗(HB98株)。第三代基因缺失疫苗是以第一、第二代基因缺失苗作为载体，表达其它病毒抗原性基因，从而可以防治多种疾病。此项研究目前正是该领域的热点问题之一。其首要问题是解决安全性和免疫效果的难关，但其前景受到普遍看好。在欧美等发达国家，得利于PRV基因缺失苗和相应鉴别诊断方法的应用，该病已得到控制或根除；但在发展中国家，该病仍频繁发生，严重制约了这些国家和地区养猪业的健康发展。就我国的实际情况看，PRV在我国的根除显然不是一个短期能实现的目标，PRV基因缺失苗在现在及将来更长一段时间内都会有广阔的市场前景。而且随着我国养殖科技化程度的逐步提高和伪狂犬根除计划的逐步开展，对PRV疫苗的需求也会更加旺盛。目前国内市场上虽然存在数种猪伪狂犬基因缺失苗，但进口疫苗售价高昂，而国产疫苗品质并不尽如人意，市场对于物美价廉的高品质国产疫苗的需求极为迫切。
技术实现思路
为此，本专利技术分离了和鉴定了猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX，并以猪伪狂犬病毒⑶XX株为母本，通过分子生物学手段，依次缺失胸腺嘧啶核苷酸激酶(PRV TK)基因和gE基因，获得重组病毒PRV/TK7gE_，以该重组病毒为疫苗毒株研制生产安全高效的猪用伪狂犬活疫苗。本专利技术的技术方案如下一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株，该病毒株的保藏名称为猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK7gE_ ;保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏日期2012年3月I日；保藏号为CCTCC V201212所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的构建方法，包括如下步骤(I)分离和鉴定猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX ；(2) TK缺失用转移载体的构建以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物扩增TK同源重组左臂Ltk ;和右臂Rtk ;用EcoRI酶切pUC19，补平后连接转化，获得消除EcoRI位点的pUC19/E ；同样方法消除HindIII，获得质粒PUC19/HE ；以KpnI本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株，其特征在于，该病毒株的保藏名称为：猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK？/gE？；保藏单位：中国典型培养物保藏中心？；保藏日期：2012年3月1日；保藏号为：CCTCC？V201212。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵定勇，黄红亮，陈瑞爱，韩静芳，唐兆新，谢小雨，任常宝，梁桂益，
申请(专利权)人：肇庆大华农生物药品有限公司，广东大华农动物保健品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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