一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法技术

本发明专利技术公开了一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法，是利用细胞悬浮工艺培养伪狂犬病毒弱毒株，使反应器内悬浮培养的BHK21-C13细胞密度大于或等于2×106细胞/mL，然后用含伪狂犬病悬浮种毒的病毒维持液进行培养，再将收获的伪狂犬弱毒病毒液经澄清、配苗、分装、冻干后得到兽用伪狂犬弱毒活疫苗。本发明专利技术能够实现伪狂犬弱毒病毒大量增殖，大大提高病毒滴度与抗原产量，实现工艺自动化，提高了疫苗的质量，不仅能提高BHK21-C13细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，疫苗质量稳定、批间差小，生产和应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域中疫苗的制备方法，特别是涉及一种用悬浮培养细胞生 产兽用伪狂犬弱毒活疫苗的方法。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV)引起的多种家畜和野生动 物的急性传染病，尤其是危害全球养猪业的重大传染病之一。 目前，伪狂犬病在世界范围内普遍发生，己有40多个国家和地区报道发生了伪狂 犬病。随着规模化养猪的不断发展和强毒株的出现，猪伪狂犬病的发生和流行日趋严重。在 我国己有20多个省市报道发生了猪伪狂犬病，并己先后分离到多株PRV毒株，己报道分离 到的毒株有闽A、陕A、京A、AKW、SR、YN、DQ-8401、S、Y株等。目前尚无针对猪伪狂犬病的有 效治疗药物，主要依靠疫苗接种、隔离感染猪群、淘汰隐性感染动物得到控制。 目前，国内生产伪狂犬疫苗的方法仍然采用原代或传代细胞系贴壁培养方法，其 采用的是传统转瓶生产工艺，具有抗原批量小、批间差大、效率低下、劳动强度大、占用场地 多等缺点。而本专利技术利用悬浮培养工艺不仅可克服上述转瓶生产工艺的缺点，而且还可提 高抗原产量、节约成本、提高产品品质，但是目前暂无生产伪狂犬弱毒活疫苗的悬浮培养工 艺及其应用的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用悬浮培养细胞生产兽用伪狂犬弱毒活疫苗的方法，以 达到规模化生产优质兽用伪狂犬弱毒活疫苗的目的。 本专利技术所提供的兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法，是利用细胞悬浮工艺 培养伪狂犬病毒弱毒株，使反应器内悬浮培养的BHK21-C13细胞密度大于或等于2XIO6细 胞/mL，然后用含伪狂犬病悬浮种毒的病毒维持液进行培养，再将收获的伪狂犬弱毒病毒液 经澄清、配苗、分装、冻干后得到兽用伪狂犬弱毒活疫苗。 其中，反应器内悬浮培养BHK21-C13细胞过程为：利用复苏的BHK21-C13悬浮细 胞株在营养液中传代悬浮培养至BHK21-C13悬浮细胞的细胞密度多2.OXIO6细胞/mL， 将悬浮细胞转移至反应器中，加入悬浮专用培养基至细胞密度0. 2-0. 5XIO6细胞/mL，在 36. 5±0. 5°C，pH值 7. 20±0. 1，D0 值 30% -60% (溶解度百分比），转速 60-110rpm下培养 48-72小时至反应器内的BHK21-C13细胞密度大于等于2XIO6细胞/mL。 所述营养液或悬浮专用培养基为：在BBSM培养基中按I. 15g/L加入碳酸氢钠，再 添加3%-5% (体积百分比）新生牛血清，调节pH值至7. 2 ±0. 5。 培养伪狂犬生产用悬浮病毒液过程为：将反应器内培养合格的BHK21-C13悬浮细 胞弃掉悬浮专用培养基，加入病毒维持液恢复至原培养体积，再按1 %体积加入伪狂犬悬浮 种毒，在36. 5 ± 0? 5°C，pH值7. 40-7. 60, DO值30%-60% (溶解度百分比），转速60-1 IOrpm 下培养，待细胞病变多75%时收获病毒液。 所述病毒维持液为：BBSM培养基中按I. 15g/L加入碳酸氢钠，再添加1% -3% (体 积比）新生牛血清，pH值7. 4±0. 5。 以上所述的生产方法中，视生产规模由小至大反应器容积依次为5L、50L、500或 5000L;且，大规模的生产使用大容积的反应器，该反应器中使用前一小规模生产容器中培 养的BHK21-C13悬浮细胞。5L、50L、500L、5000L反应器中的培养方法及培养条件相同。 所述生产方法中，所述伪狂犬病悬浮种毒是用BHK21-C13悬浮细胞培养伪狂犬基 础种毒培养的伪狂犬生产用悬浮种毒，具体获得过程如下： 1)伪狂犬基础种毒培养 取贴壁培养得到的长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养 液，加入含1% (体积百分比）伪狂犬病弱毒种毒的病毒维持液（维持液同权利要求5)， 在37°C培养，当细胞病变多75% (数量百分比）时收获病毒液，-20°C冷冻保存，取样检测 TCID5tl，每 0?ImL病毒含量应彡KftlTCID5ci; 2)伪狂犬生产用悬浮种毒培养 将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞，弃掉细胞营养液，加入病毒维持 液恢复至原培养体积，再按1% (体积百分比）加入伪狂犬基础种毒，PH值7. 40-7. 60， 0020%-60%(溶解度百分比），转速60-110印111，温度36.0±0.51：条件下累计悬浮培养 72-96h，待细胞病变彡75% (数量百分比）时收获病毒液，-20°C冷冻保存； 为适应大规模生产，伪狂犬生产用悬浮种毒还包括哪些在反应器中传代扩大培养 至种毒批所需体积的部分，即将步骤2)收获的病毒液经反应器扩大培养1-2代得到的生产 用伪狂犬病悬浮种毒批。 所述生产方法中，兽用伪狂犬弱毒病毒液的澄清采用0. 45ym滤芯正压过滤； 冻干包括：预冻阶段：常温进箱，l_2h将制品降至-42°C并维持2h;升华干燥 阶段：1-2h将制品从-42°C升至-8°C并维持IOh ;0. 5-lh将制品从-8°C升至0°C并维持 0. 5-lh ;解吸干燥阶段：1-2h将制品从0°C升至28°C并维持7h，冻干结束。 本专利技术用悬浮培养细胞生产兽用伪狂犬弱毒活疫苗，实现了规模化生产优质兽 用伪狂犬弱毒活疫苗。该方法的核心是利用生物反应器大规模悬浮培养BHK21-C13细胞 并接种伪狂犬种毒，调节培养参数使伪狂犬病毒大量繁殖，从而获得高浓度及高滴度的伪 狂犬病毒，病毒液经澄清、稀释、冻干制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗。利用本专利技术提供的用 BHK21-C13悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗工艺，作为伪狂犬病毒宿主细胞的 BHK21-C13细胞悬浮培养非常成功，培养体积可达5000L，细胞密度达到2-4XIO6细胞/mL。 本专利技术能够实现伪狂犬弱毒病毒大量增殖，大大提高病毒滴度与抗原产量，实现工艺自动 化，提高了疫苗的质量，解决了传统转瓶培养BHK21-C13细胞生产伪狂犬病毒产量低、疫苗 效力低、免疫剂量大等技术难题。本专利技术还克服了目前工艺繁琐、抗原含量低，效力低，剂量 大、批间差大等技术难题，不仅能提高BHK21-C13细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖 的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，疫苗质量稳定、批间差小，生 产和应用前景广阔。 下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。【附图说明】 图1为本专利技术用悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗的工艺流程图【具体实施方式】 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本专利技术生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提 示替换使用。 实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本专利技术，但是本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。 实施例1、用悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗 如图1所示，本专利技术用悬浮培养细胞制备兽用伪狂犬弱毒活疫苗的主要工艺流程 包括以下五个步骤：1、悬浮BHK21-C13种细胞培养；2、悬浮BHK21-C13细胞5L、50L、5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法，是利用细胞悬浮工艺培养伪狂犬病毒弱毒株，使反应器内悬浮培养的BHK21‑C13细胞密度大于或等于2×106细胞/mL，然后用含伪狂犬病悬浮种毒的病毒维持液进行培养，再将收获的伪狂犬弱毒病毒液经澄清、配苗、分装、冻干后得到兽用伪狂犬弱毒活疫苗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郝鹏，刘国英，苍枫，范秀丽，孔彩平，纪燕，温谢，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15