本发明专利技术公开了一种融合基因HSP65-PEAⅠ，它是由结核杆菌热休克蛋白65的基因和PEA受体结合亚基基因连接制得的融合基因，用该基因表达的融合蛋白HSP65-PEAⅠ在不加任何佐剂的情况下免疫小鼠，3倍LD50剂量PEA天然毒素攻毒，保护率均达到100%，5倍LD50剂量攻毒，保护率均达到80%以上，家兔在三次免疫后，制造三度烧伤多器官功能衰竭动物模型，并人为感染绿脓杆菌PA103菌，免疫实验组10天内无多器官衰竭症状发生并全部存活；融合蛋白HSP65-PEAⅠ作为抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗，可用于创烧伤高危作业人员，特别是战前参战人员的预防或紧急免疫，预防绿脓杆菌感染，防止创烧伤感染多器官衰竭综合症和休克的发生，增加战场烧烫伤抢救成活率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程及疾病防治领域，具体地涉及一种融合蛋白HSP65-PEA I，以及融合蛋白HSP65-PEA I作为疫苗在防治绿脓杆菌感染，特别是预防烧烫伤感染多器官衰竭、休克中的应用。
技术介绍
烧伤，是重要的战伤之一。不同国家军队，不同对手的战争，烧伤比例差别很大。美军在一、二次世界大战以及朝鲜战争、越南战争中，平均烧伤比例为总受伤人数的6%。第三世界国家军队由于面对大规模杀伤性武器如凝固汽油弹、白磷弹，烧伤比例要比美军高的多，可以达到16%。在现代高技术局部战争条件下，随着导弹、贫铀弹、燃料空气弹、联合攻击弹药、油气炸弹、微波武器等高压高温高爆性武器的大范围应用，参战人员烧伤发生率急剧增加，所以，对烧伤的有效救治，降低严重烧伤感染死亡率是战伤医学的一项重要任务。烧伤引起伤员的免疫抑制状态，继发细菌感染，引起机体败血症，在细菌毒素和炎症反应的双重作用下，导致多器官衰竭，这是烧伤死亡的主要原因，严重烧伤抢救成功与否的关键之一是抗感染。其中烧伤感染中绿脓杆菌的感染最为突出和棘手，感染后细菌产生的毒素更是引起伤员休克和多器官衰竭致死的首要原因。战争恶劣条件下烧伤后严重感染致死形势则更为严峻，尤其是烧伤后感染绿脓杆菌，绿脓杆菌清创后检出率为2.7%, 20天后检出率为34.4%，不仅检出率越来越高，而且抗药性也越来越强，致使临床对烧伤感染的治疗不能收到理想的效果，死亡率仍然很高。有调查显示，在烧伤患者中绿脓杆菌的检出率高居各种感染菌首位。此外，在严重呼吸道和泌尿道感染也很常见。绿脓杆菌外毒素A (PEA)是引起伤员死亡的主要原因，识别和结合PEA的受体广泛存在于人体所有细胞上，可造成人体细胞大范围死亡，引起组织坏死、器官功能衰竭，最终导致伤员因肺脏、心脏、肾脏、肝脏等多系统器官衰竭(MODS)而死亡。 绿脓杆菌对人和各种动物均具有易感性，属人兽共患性病原菌，广泛分布于土壤、水和空气中，其生态多样性决定了它的代谢多样性。该菌属机会致病菌，常存在于动物和人的皮肤、呼吸道、消化道和泌尿道中，在正常防御能力机体中，绿脓杆菌作为常居菌与宿主共生，成为健康携带菌者，而不会发病，只有当宿主防御功能不健全或受损时，这种共生状态才会发生紊乱，发生异常增殖并具有致病性。严重烧伤、外科创伤或术后的免疫虚损宿主、插管治疗病人、癌症、器官移植病人、慢性消耗性疾病、原发或继发性免疫缺陷病人、中性粒细胞减少症、HIV、严重营养不良造成的免疫功能低下及广泛应用抗生素者以及新生儿、早产儿等免疫机能不健全者都易发生绿脓杆菌感染，广泛侵袭机体各个脏器组织，引起各种病变和炎症，甚至发生败血症。在对医院主要致病菌的调查中显示，绿脓杆菌位列第三位，仅次于大肠杆菌和克雷伯氏菌。绿脓杆菌感染人主要发生在大面积烧伤后的继发感染和囊性纤维化患者(CF)，严重者可引起全身性败血症、脑膜炎或多器官衰竭，一旦发生败血症，其死亡率高达44% 81%，多器官衰竭达70%，整体死亡率高达50%。由于绿脓杆菌具有天然耐药性以及广谱抗生素的泛滥使用，使得多重耐药绿脓杆菌感染的情况日益严重。绿脓杆菌菌能产生外毒素A (PEA)、内毒素(LPS)、外膜蛋白、纤毛、肠毒素、溶血酶、杀白细胞素、弹性蛋白酶、胶原酶、胰肽酶及多种胞外S、磷脂酶C (或白细胞素)等致病因子，能广泛侵袭机体各个脏器组织，引起各种病变和炎症。菌体崩解后释放出的内毒素，主要成分为毒力相对较弱的LPS，2 3mg才能致死20g体重小白鼠；另一种毒素为是一种溶血物质:磷脂酶C，它能给入侵的细菌提供营养，增强其毒力，用磷脂酶C注射小白鼠，24小时内可以将小鼠致死。PEA是该菌毒力最强的毒力因子，是一种致死性的外毒素，是其内毒素毒力的I万倍，PEA注入动物体后，其主要靶器官肝脏会出现细胞肿胀、脂肪变性及坏死性病变；其他脏器病变有肺出血和肾脏坏死等，其中以肝细胞坏死最为严重，使肝脏内组织病理学改变，诱导肝细胞凋亡。绿脓杆菌外毒素A是绿脓杆菌的代谢产物，是一种热不稳定单链多肽分子，分子量为66KDa，毒力很强，用5 10倍LD50腹腔注射小白鼠可引起白细胞、血小板迅速减少，凝血时间延长，外周血液中消失的血小板沉积于肺中。PEA可用甲醛或戊二醛脱毒使其毒力减弱，作为类毒素防治绿脓杆菌感染的作用。近几年来，科学家们研究的焦点主要集中在PEA的分子结构与其毒力强弱的关系上，通过基因工程技术对外毒素A基因定点敲除的方式进行改造，研制无毒性或者毒性很弱的突变体，为外毒素疫苗的研究创造了良好的条件。在对PEA的分子结构与作用机制有一定研究的基础上，利用PEA的细胞毒性作用制成免疫毒素，作为治疗癌症的药物；人们又利用基因工程技术将其改造为具有医疗用途的蛋白质，利用PEA良好的免疫原性制备基因工程疫苗，防治绿脓杆菌感染；利用PEA的载体蛋白功能，可携带外源蛋白或DNA进入细胞中用于基因治疗；同时PEA也是优良的疫苗佐剂和疫苗载体，可以大大增强疫苗的免疫原性，然而绿脓杆菌菌株多，毒力差异大，GeneBank已发表的全长 PEA 序列只有三个(AE004091，strainPAOl ；Cp000438, strainUCBpp-PA14 ；K01397 ；strainPA103)，Blast序列比对分析结果显示，PEA碱基序列与氨基酸序列之间均存在明显差异。研究不同菌株间PEA碱基序列、分子结构和PEA蛋白生物活性的差异可以很好的揭示PEA结构与细胞毒性及免疫原性的关系，为PEA更好的应用于免疫毒素、疫苗研究和基因治疗打下了良好的基础。绿脓杆菌外毒素A是一种外分泌性蛋白，属于细菌性ADP核糖基转移酶家族的一员，它与白喉毒素(DT)，霍乱毒素等一样。在菌体内以638个氨基酸的前体形式合成，经翻译加工后分泌至胞外，在氨基末端有25个氨基酸的高度疏水的先导肽，并以酶前体的形式(即检测不到其ADP-核糖基化活性)分泌到绿脓杆菌的周质空间内，在周质空间内被酶切后成为含有613个氨基酸的成熟毒素蛋白并分泌到细菌细胞外。成熟的PEA是由613个氨基酸组成，分子量是66.58KD，等电点是5.0,由三个结构域组成，当在酸性条件下时，由于毒素蛋白结构会受PH影响而伸长，使得酶切位点暴露出来，而能够被蛋白酶进行酶切，酶切后的部分包含第三结构域部分因为空间结构改变使得核糖基转移活性区域暴露而具有核糖基转移酶的活性，来催化NAD+和真核蛋白延长因子-2 (EF-2)的核糖基化反应。在体内只有PEA进入动物细胞浆后才有活性，而在体外则需经过尿素(4.0mol/L)或二巯基乙醇(1%)处理后才能检测到活性。PEA的编码结构基因经测定位于细菌染色体上，是单一顺反子。经X射线衍射晶体可知:PEA含有三个不同的结构域(Domain,D),即Domain I (受体结合区)、Domain II (跨膜区)和Domain III (催化区)。其中Domain I又包含Domain Ia和Domain Ib两部分，它们在空间结构上靠近，但在一级结构中并不相连。Domain Ia由第I 252位的氨基酸组成,Domain II由第253 364位的氨基酸组成,Domain III由第400 613位的氨基酸组成。Domain I位于PEA分子的氨基端(N端本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白基因HSP65?PEAⅠ，它是由结核杆菌热休克蛋白65的基因HSP65和PEA受体结合亚基基因PEAⅠ顺序连接制得。
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白基因/，它是由结核杆菌热休克蛋白65的基因和PEA受体结合亚基基因PEA I顺序连接制得。2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白基因/，其特征在于:所述的抗PEA抗体受体结合亚基基因产说/，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。3.根据权利要求1或2所述的一种融合蛋白基因/其特征在于:所述的结核杆菌热休克蛋白65基因57奴^，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。4.根据权利要求1所述的一种融合基因/，其碱基序列如序列表SEQIDN0.3所示。5.一种融合蛋白HSP65-PEA I，它是由权利要求1所述的一种融合基因表达的蛋白。6.根据权利要求5所述的一种融合蛋白HSP65-PEAI ,其特征在于:其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.4所示。7.一种融合蛋白HSP65-PEA I的制备方法，它包括以下步骤: 1)用引物: Fh: GCCCATGGATGGCCAAGACAATTGCGTACGARh:ACGAATTC...
【专利技术属性】
技术研发人员：张国利，冯越，朱平，岳玉环，吴广谋，田园，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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