本发明专利技术提供一种伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法，用伪狂犬病病毒接种BHK细胞，在生物反应器内进行细胞悬浮培养，收获病毒液，经甲醛灭活后，加入吐温‑80制成水相，然后与油佐剂或水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗。本发明专利技术首次采用BHK细胞系生产伪狂犬病病毒(Bartha‑K61株)灭活疫苗，为伪狂犬疫病的防控提供了有效措施。采用BHK细胞悬浮培养的生产方式具有无外源因子污染，易于规模化生产，能较好的维持病毒抗原稳定等优点，并能缩短疫苗研发周期与生产周期，具备突发疫情中疫苗供应应急的能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品
，具体地说，涉及一种伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种急性传染病，被国际动物卫生组织(OIE)列为B类传染病。临床症状为发热、奇痒、红肿、出血；全身阵发性痉挛；磨牙、鸣叫；四肢麻痹、倒地不起和脑脊髓炎等。其宿主范围非常广泛，猪是该病原的天然宿主和传染源，此病对养猪业危害极大，蛀牙引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率及种猪不育。该病最早发现于美国，目前分布于全世界50多个国家和地区，对养猪业的发展构成了严重的威胁，已引起世界各国的高度重视。该病在我国的发生也已比较严重，是现在危害我国规模养猪业最严重的疫病之一。疫苗是预防、控制甚至消灭伪狂犬病最主要的措施之一。国内外已研制出常规弱毒疫苗、灭活疫苗、基因缺失疫苗等。但PRV是一种疱疹病毒，可在感染猪体内形成持续感染，终身带毒，常规弱毒苗免疫可以控制发病，但不能清除病毒。目前，在国外，弱毒疫苗的应用比较普遍，但是未经充分致弱的弱毒疫苗的毒力可能返强而导致疾病流行，从而建立潜伏感染，并存在散毒的风险；采用PRV基因缺失弱毒苗进行防控PR，这为伪狂犬病的根除计划打下了基础，但这种疫苗生产方式操作较为复杂，且需要操作熟练的研究人员；传统灭活疫苗生产方式不能满足未来我国对伪狂犬病的预防与控制需求，主要表现在以下几个方面：(1)生产周期长，难以在短时间内实现大规模疫苗生产；(2)生产工艺落后，劳动力密集，生产成本高。鉴于伪狂犬病病毒灭活疫苗在我国猪病防控过程中的重要作用，亟待开发一种制备伪狂犬病灭活疫苗的新工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，用伪狂犬病病毒接种BHK细胞，在生物反应器内进行细胞悬浮培养，收获病毒液，经甲醛灭活后，加入吐温-80制成水相，然后与油佐剂或水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗。本专利技术中涉及的伪狂犬病病毒为Bartha-K61株，所述BHK细胞为BHK-21。前述的方法，按病毒与细胞总数之比1:1000-1:100进行接种。前述的方法，病毒接种的BHK细胞为悬浮培养的BHK细胞，待细胞培养液中BHK细胞密度达3.0×106/ml-8.0×106/ml后接种病毒。前述的方法，在生物反应器内进行细胞悬浮培养的条件为：37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm，培养24-72h；本专利技术使用的生物反应器为&CELLIGEN310Fermentor/Bioreactor。本专利技术使用的细胞培养液为BS-SFMV液体培养基(购自苏州市沃美生物技术有限公司，商品编号BSS20314-2)，pH值7.0-7.4。前述的方法，待细胞完全病变后，停止培养，冻融，离心，取上清，测定TCID50值，在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范围为检验合格的病毒液，向病毒液中加入终浓度0.1％-0.15％的甲醛(优选甲醛终浓度0.15％)，37℃灭活24h-36h(优选24h)。前述的方法，向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与油佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，水相与油佐剂的质量比为3:7-9:1，优选1:2；所述油佐剂是由白油、司盘-80和硬脂酸铝按93:5:2的质量比组成。前述的方法，向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，所述水佐剂为聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为1％-10％，优选1％-3％。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述伪狂犬病灭活疫苗按以下方法制备得到：(1)接种所用病毒液的制备：用病毒生长液将伪狂犬病病毒Bartha-K61株进行倍比稀释后，以1‰比例接种已长成单层的BHK-21细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中，培养24-72h，待75％细胞出现病变后停止培养，反复冻融3次后收获，12000r/min离心10min，取上清，测定病毒液的TCID50值，分装后保存于-20℃备用；(2)BHK-21细胞系的悬浮培养与传代：将悬浮培养的BHK-21细胞计数后，用细胞培养液稀释成一定浓度后，接种至生物反应器内，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm的条件下进行细胞悬浮培养24-72h，待细胞长到密度达3.0×106/ml-8.0×106/ml后进行传代或接种病毒；(3)病毒在悬浮培养细胞上的增殖：用病毒生长液将伪狂犬病病毒Bartha-K61株进行倍比稀释后，按照病毒与细胞总数之比1:1000-1:100进行接种，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm的条件下振荡培养24-72h，待细胞完全病变后，停止培养，反复冻融3次后收获，12000r/min离心10min，取上清，测定病毒液的TCID50值，分装后保存于-20℃备用；(4)甲醛灭活：向检验合格的病毒液中加入终浓度0.15％的甲醛，37℃灭活24h；(5)伪狂犬病灭活疫苗的制备：向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与油佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，水相与油佐剂的质量比为1:2；所述油佐剂是由白油、司盘-80和硬脂酸铝按93:5:2的质量比组成；或者向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，所述水佐剂为聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为1％-3％；其中，步骤(1)和(3)中所用病毒生长液为DMEM高糖液体培养基(购自bylifetechnologiesTM，商品编号12800-0581L)。本专利技术首次采用BHK细胞系生产伪狂犬病病毒(Bartha-K61株)灭活疫苗，为伪狂犬疫病的防控提供了有效措施。采用BHK细胞悬浮培养的生产方式具有无外源因子污染，易于规模化生产，能较好的维持病毒抗原稳定等优点，并能缩短疫苗研发周期与生产周期，具备突发疫情中疫苗供应应急的能力。通过伪狂犬灭活疫苗对猪的攻毒保护试验结果表明，本专利技术的伪狂犬病灭活疫苗产品具有良好的安全性，免疫后可产生理想的免疫保护效果，可作为犬科动物伪狂犬疫病防控的候选疫苗株。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本专利技术中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。若无特别说明，本专利技术中所述的“份”是指“重量份”。以下实施例中所用病毒生长液为DMEM高糖液体培养基(购自bylifetechnologiesTM，商品编本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，用伪狂犬病病毒接种BHK细胞，在生物反应器内进行细胞悬浮培养，收获病毒液，经甲醛灭活后，加入吐温‑80制成水相，然后与油佐剂或水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗。
【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，用伪狂犬病病毒接种BHK细胞，在生物反应器内进行细胞悬浮培养，收获病毒液，经甲醛灭活后，加入吐温-80制成水相，然后与油佐剂或水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述伪狂犬病病毒为Bartha-K61株，所述BHK细胞为BHK-21。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，按病毒与细胞总数之比1:1000-1:100进行接种。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，病毒接种的BHK细胞为悬浮培养的BHK细胞，待细胞培养液中BHK细胞密度达3.0×106/ml-8.0×106/ml后接种病毒。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在生物反应器内进行细胞悬浮培养的条件为：37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，摇床转速120-130rpm，培养24-72h；其中，所用细胞培养液为BS-SFMV液体培养基，pH值7.0-7.4。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，待细胞完全病变后，停止培养，冻融，离心，取上清，测定TCID50值，在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范围内为检验合格的病毒液，向病毒液中加入终浓度0.1％-0.15％的甲醛，37℃灭活24h-36h。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与油佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，水相与油佐剂的质量比为3:7-9:1，优选1:2；所述油佐剂是由白油、司盘-80和硬脂酸铝按93:5:2的质量比组成。8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，向灭活的病毒液中加入吐温-80制成水相，其中，灭活的病毒液与吐温-80的质量比为9:1；然后将水相与水佐剂混合乳化制成伪狂犬病灭活疫苗，其中，所述水佐剂为聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的浓度为1％-10％，优选1％-3％。9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)接种所用病毒液的制备：用病毒生长液...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨君敬，王贺民，习硕，杨小蓉，严石，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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