一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法及疫苗制品技术

本发明专利技术涉及一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法，该方法包括以下步骤：(1)制备悬浮传代细胞；(2)扩增培养该步骤(1)制备的悬浮传代细胞；以及(3)在该步骤(2)扩增培养后的悬浮传代细胞接种伪狂犬病病毒，扩增培养伪狂犬病病毒。本发明专利技术方法较现有技术中的生产方法相比，简化了生产工艺，降低了成本。对市场流行的高致病性伪狂犬毒株的攻击，能起到很好的保护，降低伪狂犬病造成的经济损失。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法及疫苗制品，属于兽药生物

技术介绍
伪狂犬病(Pseudoraties，Pr)，是由疱疹病毒科猪疱疹病毒I型伪狂犬病病毒引起多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的自然宿主和储存者，仔猪和其他易感动物多为急性致死性症状，具有明显的神经症状、死亡率高达100％；成年猪多为隐性感染，表现为繁殖障碍与呼吸道症状。疫苗免疫是防制伪狂犬病的主要措施。2013年广东、江西、河南、山西、湖南等地猪场都在免疫伪狂犬疫苗后仍出现猪伪狂犬病部分流行案例，2014伪狂犬病在河北、河南、湖北等地的一些猪场暴发流行，给发病猪场带来巨大的损失，说明现有商品化的伪狂犬疫苗已不能对市场流行毒株起到很好的保护。其原因主要在于，伪狂犬灭活疫苗由于其在免疫动物体内无法繁殖，需要较高的抗原量，而现有技术的抗原量较低(107.0TCID50/0.1ml)，如采用浓缩方法虽能提高抗原量，但也会增加杂蛋白量，增加了疫苗的副反应。因此，急需攻克制备高滴度的猪伪狂犬病病毒疫苗的技术难题。目前商品化猪伪狂犬病病毒疫苗的制备工艺主要采用转瓶培养工艺，即将伪狂犬病病毒接入已经贴壁的传代细胞或原代细胞，培养一段时间后收获病毒液。如专利申请CN101695573A公开了一种利用传代细胞生产伪狂犬病病毒疫苗的方法，利用传统的转瓶生产工艺，用ST、PK15和IBRS-2传代细胞来繁殖伪狂犬病病毒。但由于转瓶培养工艺中，每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和病毒滴度都不相同，导致疫苗批间差异大；转瓶操作暴露点多，容易造成污染或隐性污染而引起病毒液报废；且操作劳动强度大，生产效率低，已不适合当前疫苗大规模生产的要求。在伪狂犬病病毒大规模培养方面，还有关于利用微载体进行生物反应器培养伪狂犬病病毒的报道。专利申请CN101695572A公开了一种利用TideCell固定床微载体生物反应器生产伪狂犬疫苗的方法；专利申请CN102038946A公开了一种利用微载体培养搅拌式的生物反应器生产伪狂犬疫苗的方法。但是上述方法，均需借助价格昂贵的微载体才能进行细胞悬浮培养，生产成本相对较高；借助微载体培养时，需使用胰酶消化，消化后细胞利用率低，生产工艺复杂。因此研制一种工艺简单稳定、批间差异小、生产效率高、并能制备高含量的病毒的猪伪狂犬病病毒疫苗的生产方法具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法及使用本专利技术所述方法制备的伪狂犬病病毒疫苗。本专利技术的第一方面是一种应用生物反应器不依赖微载体制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备悬浮传代细胞；(2)扩增培养所述步骤(1)制备的悬浮传代细胞；以及(3)在所述步骤(2)扩增培养后的悬浮传代细胞接种伪狂犬病病毒，扩增培养伪狂犬病病毒。作为本专利技术的一种优选实施方式，所述步骤(a)中所述的传代细胞系为BHK-21细胞，来源于美国典型培养物典藏中心(ATCC)，保藏号为：CCL-10；所述伪狂犬病病毒毒株优选猪伪狂犬变异株及其基因缺失株。术语“猪伪狂犬变异株”也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。最优选地，所述伪狂犬病病毒毒株包括伪狂犬变异株及其基因缺失株，所述伪狂犬变异株包括但不限于猪伪狂犬病病毒HN1201株(Pseudorabiesvirus,strainHN1201)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201311，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日；JS-2012株，公开于童武，张青占，郑浩等，免疫后发病仔猪中伪狂犬病病毒的分离和鉴定[J].中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)；猪伪狂犬HeN1株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.6656，公开于专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株，公开于文献XiulingYu,ZhiZhou,DongmeiHu,etal.PathogenicPseudorabiesVirus,China,2012EmergingInfectiousDiseases，www.cdc.gov/eidol.20,No.1,January2014)；猪伪狂犬病病毒HN1202株(Pseudorabiesvirus,strainHN1202)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201335，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日；PRVTJstrain(PRVTJ)株，公开于文献ChinaChun-HuaWangJinYuan,Hua-YangQin，etal，AnovelgE-deletedpseudorabiesvirus(PRV)providesrapidandcompleteprotectionfromlethalchallengewiththePRVvariantemerginginBartha-K61-vaccinatedswinepopulationinChinaVaccine32(2014)3379–3385；猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo.8170，公开于专利申请CN103627678A；所述伪狂犬变异株的基因缺失株包括但不限于缺失gE基因的猪伪狂犬病HN1201株，公开于中国专利申请CN103923884A；猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G株，保藏号为CGMCCNo.7957，公开于中国专利申请CN103756977A；猪伪狂犬病gE基因缺失株，保藏号为CGMCCNO.6657，公开于中国专利申请CN102994458A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备悬浮传代细胞；(2)扩增培养所述步骤(1)制备的悬浮传代细胞；以及(3)在所述步骤(2)扩增培养后的悬浮传代细胞接种伪狂犬病病毒，扩增培养伪狂犬病病毒。

【技术特征摘要】
1.一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法，其特征在于，所述方法
包括以下步骤：
(1)制备悬浮传代细胞；
(2)扩增培养所述步骤(1)制备的悬浮传代细胞；以及
(3)在所述步骤(2)扩增培养后的悬浮传代细胞接种伪狂犬病
病毒，扩增培养伪狂犬病病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述传代细胞包括BHK-21细胞；
所述伪狂犬病病毒毒株包括伪狂犬病病毒变异株，优选地，所述
伪狂犬病病毒毒株包括猪伪狂犬病病毒HN1201株、猪伪狂犬病病毒
HN1201株gE基因缺失株及其培养物(5-35代以内)的活的全病毒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中
扩增培养悬浮传代细胞采用连续放大方式培养，所述连续放大方式中
单次培养前悬浮传代细胞浓度为0.2×106个/ml～2×106个/ml，所述单
次培养过程至悬浮传代细胞浓度为1×106个/ml～10×106个/ml时结束。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中
扩增培养悬浮传代细胞采用连续放大方式培养，所述连续放大方式中
单次培养前悬浮传代细胞浓度为0.6×106个/ml～1×106个/ml，所述单
次培养过程至悬浮传代细胞浓度为3×106～6×10...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，孙进忠，王进产，张许科，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41