筛选抗体表达细胞的方法技术

一种筛选高水平抗体生成细胞的方法，包括将Ａ蛋白或Ｇ蛋白附着于细胞表面上的步骤，从而捕获所分泌的可溶性抗体。通过常规的方法对捕获抗体进行荧光染色，然后进行ＦＡＣＳ分析，从而筛选出低丰度高产单细胞。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术的抗体生成领域。本专利技术的一个目的是设计一种筛选抗体生成细胞的方法以及对细胞系稳定性进行评估的方法。筛选相对于非抗体生成细胞的抗体生成细胞，特别是筛选一种高效抗体生成细胞系在任何生物过程的研发过程均是非常重要的第一步。对于由动物细胞生成蛋白质，这些传统上筛选出的细胞系已经经过多轮有限稀释克隆以及随后的产品分析所分离出来。这种传统过程非常耗时而且比较昂贵。为了提高克隆的理论可信度需要进行两轮克隆。克隆对于避免由于低生成力变种所导致的高产细胞的过度生长是很重要的，所述低生成力变种通常具有比高产细胞还要高的生长率。总体上，完成传统过程需要超过8个月的时间。而且，实际需要考虑的事项限制了事实上所筛选出的细胞数，这就使得只能凭运气才能检测出低丰度的高产细胞克隆。在研发过程中，对细胞系稳定性进行评价需要进一步的分析克隆，其需要花费6到7个星期的时间。另外，分析克隆涉及对200-300个克隆进行评估，与可以借助流式细胞术对数千个克隆所进行的分析相比，其提供了一个关于非生成群体的大小的更加详细和准确的图象。以前所报道的分泌检测的灵敏度较低，不足以对不同的亚种群进行分辨，从而不能对不同的亚种群进行量化。流式细胞术(FC)使得对大量细胞的生产力进行监测成为可能，并且可以分离出适当的单个细胞。流式细胞术需要用荧光团标记细胞，在流式细胞术中对细胞的荧光进行定量，并且与所需要的特性相关联。然而，在细胞系表面所显示的膜结合抗体的数量与该细胞系的可溶性抗体的分泌率之间的相关性不是很好(Meilhoc等，流式细胞计数测量表面IgG在低血清或无血清培养基中的鼠杂交瘤细胞系合成和分泌单克隆抗体的动力学分析中的应用(Application of flow cytometric measurement of surface IgG in kinetic analysis ofmonoclonal antibody synthesis and secretion by murine hybridoma cell-line in lowserum and serum-free media)，Hybridoma 9，67-175)。因此，简单地用检测抗体对所显示的抗体进行染色不能有效地分离出高产的细胞克隆。为了解决该问题，选择了两个本质上完全不同的方法，以直接筛选分泌抗体的高效生成细胞。在第一种方法中，单个细胞及其分泌的抗体被包囊在凝胶滴中。然后对整个凝胶滴进行标记，并通过FC进行分类。该方法的缺点在于，该方法对用户来说不是很友好，即为了确保凝胶滴中只含有单个细胞，只有5％的凝胶滴中包含一个细胞，而所分析的大约95％的凝胶颗粒中不含细胞。另外，包囊/去包囊可以导致一些通常用于重组蛋白质表达的细胞类型的生存能力降低，最显著的是骨髓瘤(meyeloma)NSO细胞。在第二种方法中，通过在细胞表面人工制造出亲合位点或受体，以保留所分泌的受体，然后用FC评估所分泌的抗体数量。Holmes等(J.of Immunol.methods，230(1999)，141-147)描述了一种在室温下对质膜蛋白进行生物素化的分析方法。生物素促进第一抗生物素蛋白和第二生物素化捕获抗体的结合。所述捕获抗体识别NSO细胞系所分泌的抗体，并将所述抗体固定于细胞表面。将带有被捕获的分泌抗体的细胞与第三个用荧光标记的检测抗体一起培养，用FC进行荧光检测并对低丰度高产出的细胞克隆进行细胞分类。向培养基中加入一种粘性剂例如胶质以防止克隆之间发生干扰(即生成细胞所产生的分泌抗体扩散和结合到非生成细胞或者低生成细胞)已经公开的方法的主要缺点在于，其对区分高产和低产细胞，以及对低丰度高产细胞的精确分类具有相对较低的灵敏度。采用已公开的方法不可能检测到给定细胞系所分泌的嵌合抗体通过捕获抗体结合到细胞表面。另外，这种捕获抗体必须来自包括胎儿血清在内的哺乳动物细胞培养物，并且通常用牛血清白蛋白进行稳定，并用作商业抗体制品。因此，使用捕获抗体会导致克隆细胞培养物有可能被病毒或BSE污染的风险。本专利技术的目的是设计出另外一种方法，能有效地从细胞克隆库中检测和筛选出适宜的表达抗体的单个细胞。此目的可以通过独立权利要求1所述的方法达到。附图中显示了本专利技术的可能实施例附图说明图1a分泌抗体的捕获和检测原理的示意图，b捕获抗体和A蛋白的结合能力的比较图2对本专利技术的分泌检测的样品进行荧光细胞计数(FC)分析。图3对分泌检测的样品进行荧光细胞计数(FC)分析，其中比较了A蛋白和抗人IgG抗体捕获分泌抗体的效果。根据本专利技术，用于筛选分泌第一抗体的细胞的方法包括以下步骤a)将抗生物素蛋白连接至细胞的细胞表面；b)将细胞与一种生物素化多肽进行培养，所述多肽至少包括一个G蛋白或A蛋白的功能性抗体结合域；c)将细胞与第二抗体进行培养，所述第二抗体用荧光标记，其识别并结合第一抗体的抗原表位，培养后，将未结合的第二抗体冲洗掉；d)筛选出结合有一定量的第二抗体的荧光标记的细胞，荧光分析流式细胞术(FC)是优选且方便的。FC允许随后对荧光标记的细胞进行分类。分泌抗体的生成细胞可以是任何用来分泌抗体的细胞，例如淋巴细胞杂交瘤、骨髓瘤或者CHO细胞。更优选地是，生成细胞是一种骨髓瘤细胞系，最优选地是，它是一种NSO细胞系。因此，抗体可以是任何天然生成的抗体或基因工程抗体或者抗体片段，例如嵌合或单价或双特异性抗体，包括近期公知的骆驼和羊驼的单重链抗体(Trends Biochem.Scien.(2001)，26，230)。根据本专利技术，这些抗体优选含有高亲和力细菌G蛋白或A蛋白的结合位点，正如不同类(IgG，IgA，IgE，IgM)免疫球蛋白(Ig)的天然Fc部分的位点。优选地，根据本专利技术的抗体包含IgG的Fc部分。最优选地是，根据本专利技术的抗体是IgG或者是包含IgG的至少一个重链。根据本专利技术的抗生物素蛋白是常规的鸟类抗生物素蛋白(大约67kD)，或者其它任何功能性的、即结合生物素的同源物质，例如来自链霉菌属的链霉抗生物素(60kD)，或任何天然生成的抗生物素的化学或基因工程变种。这些变种的一个例子是Neutravidin(Pierce，Pockford/IL)，该物质为不含糖的去糖基抗生物素蛋白，pI在6-7之间，可以对其进行进一步的改造使其不包含链霉抗生物素的三肽RYD区域，所述区域可以介导细胞表面受体的非特异性结合。优选地是，根据本专利技术的抗生物素蛋白是鸟类抗生物素蛋白，去糖基化的鸟类抗生物素蛋白，或是一种neutravidine。最佳的是，根据本专利技术的抗生物素蛋白是neutravidine。这些neutravidine显示具有最大的生物素结合能力，其结合能力大约为14微克生物素/毫克蛋白。抗生物素蛋白能通过例如交联的方法连接到细胞表面。可以使用本领域公知的常见的双功能交联剂，其包含反应基团例如环氧乙烷，乙醛，琥珀酸亚胺或者光反应化合物，例如N-生物胞素氧基，SAND(磺基琥珀酰亚胺基2--乙基-1，3-二硫代丙酸)。不言而喻的是，或者是与脂质的活性基团(例如磷酸丝氨酸的羟基官能团)，或者更可能的是与膜蛋白表面上的反应基团发生所述交联。在一个优选实施例中，抗生物素蛋白通过带有生物素标记的单功能交联本文档来自技高网...

【技术保护点】
筛选分泌第一抗体的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：ａ）将抗生物素蛋白连接到细胞的细胞表面；ｂ）将所述细胞与含有至少一个功能性抗体结合域的生物素化多肽一起培养；ｃ）将细胞与第二抗体或抗原一起培养，该第二抗 体或抗原是荧光标记的并且识别和结合第一抗体上的抗原表位；ｄ）筛选结合了一定量第二抗体的荧光标记的细胞，优选通过荧光分析流式细胞术进行筛选。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A雷切尔，R辛格，
申请(专利权)人：隆萨集团股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]