筛选抗体的方法技术

本发明专利技术提供生产用于抗体筛选试验的抗体偶联物的方法和由权利要求的方法生产的抗体偶联物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求于2010年3月2日提交的美国临时申请第61/309，725号和2010年4月13日提交的美国临时申请第61/323，433号的权益，每个申请都通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
技术介绍
癌症细胞上的抗体药物偶联物(ADC)的活性能受到众多因素的影响，例如结合亲和性、内化速率、亚细胞运输和靶标细胞群内有效的药物释放。因此，用于药物递送的理想抗体的属性与用 于治疗性非偶联抗体的那些不是必需相同。另外，由于细胞表面的交联能造成下游事件的改变，并且二抗的所述亲和性限制试验的动态范围，涉及使用二抗以筛选最佳ADC的间接试验可能会误导。由于这些结果提供能影响细胞毒性活性的参数的直接测量，当寻求针对ADC治疗新抗原的候选抗体时，因此最需要筛选ADC形式的大量抗体组和评价其细胞毒性活性。然而，当处理抗体开发活动常见的微克数量的大量抗体时，传统偶联方法的产率有限制。需要筛选抗体用作ADC的改进方法。本专利技术解决了这种和其它需求。
技术实现思路
本专利技术提供生产用于抗体筛选试验的抗体偶联物的方法和由权利要求的方法生产抗体偶联物。在一些实施方式中，所述方法包含提供含有第一和第二抗体样品的方法，其中所述含有第一和第二抗体样品根据抗体数量和抗体序列不相同，前提是所述第一样品中出现的所有抗体基本具有相同序列并且所述第二样品中出现的所有抗体基本上是相同序列；固定所述抗体到固体支持物上以提供包含固定抗体的第一和第二样品；充分还原所述固定抗体的可还原二硫键以提供包含经还原固定抗体的第一样品和包含经还原固定抗体的第二样品，其中所述还原对可还原二硫键有选择性；还原的固定抗体与封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂反应以提供固定抗体偶联物，其中所述封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂与活性巯基选择性反应，所述封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂以摩尔过量提供，并且选择封端剂、药物或药物接头和可选检测剂的比率以实现所需药物加载水平；和洗脱所述抗体偶联物以提供游离抗体偶联物的第一样品和游离抗体偶联物的第二样品。在一些实施方式中，所述方法包含提供含有多个杂交瘤克隆所生成未定量抗体的多个未纯化杂交瘤上清液样品的步骤，其中所述多个样品根据抗体数量和抗体序列不相同，前提是大部分的所述多个样品中，每个样品中出现的所有抗体基本上来自单个杂交瘤克隆；固定所述未定量抗体到固体支持物上以提供包含固定抗体的多个样品；充分还原所述固定抗体的链间二硫键以提供包含经还原固定抗体的多个样品；还原的固定抗体与封端齐U、药物或药物接头和检测剂反应以提供固定抗体偶联物，其中所述封端剂、药物或药物接头和检测剂与活性巯基选择性反应，所述封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂以摩尔过量提供，并且选择封端剂、药物或药物接头和检测剂的比率以实现所需药物加载水平；和从所述固体支持物洗脱所述抗体偶联物以提供多个抗体偶联组合物。在一些实施方式中，所述方法包含提供含有根据抗体数量和抗体序列不相同的样品的多个抗体的步骤，前提是大部分的所述多个包含抗体样品中，单一样品中出现的所有抗体基本具有相同序列；固定所述抗体到固体支持物上以提供包含固定抗体的多个样品；充分还原所述固定抗体的可还原二硫键以提供包含经还原固定抗体的多个样品，其中所述还原对可还原二硫键有选择性；还原的固定抗体与封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂反应以提供包含固定抗体偶联物的多个样品，其中所述封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂与活性巯基选择性反应，所述封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂以摩尔过量提供，并且选择封端剂、药物或药物接头和可选检测剂的比率以实现所需药物加载水平；和洗脱所述抗体偶联物以提供含游离抗体偶联物的多个抗体偶联组合物。在一些实施方式中，所述方法包含提供含有根据抗体数量和抗体序列不相同的样品的多个抗体的步骤，前提是大部分的所述多个包含抗体的样品中，单一样品中出现的所有抗体基本具有相同序列；固定所述抗体到固体支持物上以提供包含固定抗体的多个样品；充分还原所述固定抗体的可还原二硫键以提供包含经还原固定抗体的多个样品，其中所述还原对可还原二硫键有选择性；还原的固定抗体与封端剂和检测剂反应以提供包含固定抗体偶联物的多个样品，其中所述封端剂和检测剂与活性巯基选择性反应，所述封端剂 剂加载水平；和洗脱所述抗体偶联物以提供含游离抗体偶联物的多个抗体偶联物组合物。在一些实施方式中，所述方法包含提供含有根据抗体数量和抗体序列不相同的样品的多个抗体的步骤，前提是大部分的所述多个包含抗体的样品中，单一样品中出现的所有抗体基本具有相同序列；固定所述抗体到固体支持物上以提供包含固定抗体的多个样品；充分还原所述固定抗体的可还原二硫键以提供包含经还原固定抗体的多个样品，其中所述还原对可还原二硫键有选择性；还原的固定抗体与封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂反应以提供包含固定抗体偶联物的多个样品，其中所述封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂与活性巯基选择性反应，所述封端剂、药物或药物接头和可选的检测剂以摩尔过量提供，并且选择封端剂、药物或药物接头和可选检测剂的比率以实现所需药物加载水平；洗脱所述抗体偶联物以提供含游离抗体偶联物的多个抗体偶联物组合物；测试所述抗体偶联物活性；和以试验结果为基础选择抗体。在一些实施方式中，所述方法包含提供含有根据抗体数量和抗体序列不相同的样品的多个抗体的步骤，前提是大部分的所述多个包含抗体的样品中，单一样品中出现的所有抗体基本具有相同序列；固定所述抗体到固体支持物上以提供包含固定抗体的多个样品；充分还原所述固定抗体的可还原二硫键以提供包含经还原固定抗体的多个样品，其中所述还原对可还原二硫键有选择性；还原的固定抗体与封端剂和检测剂反应以提供包含固定抗体偶联物的多个样品，其中所述封端剂和检测剂与活性巯基选择性反应，所述封端剂和检测剂以摩尔过量提供，并且选择封端剂和检测剂的比率以实现所需检测剂和/或封端剂加载水平；洗脱所述抗体偶联物以提供含游离抗体偶联物的多个抗体偶联物组合物；测试所述抗体偶联物活性；和以试验结果为基础选择抗体。根据下面详细描述、特定实施方式的非限定示例和附图，可以更充分理解本专利技术的这些和其他方面。附图简要说明图I.本图提供鼠IgGl的疏水相互作用色谱图，鼠IgGl采用其未偶联形式(虚线)，充分还原和与溶液中的mcMMAF偶联(重实线)，和固定在蛋白G琼脂糖上时充分还原和与mcMMAF偶联(轻实线)。图2.本图显示在包含mcMMAF和需要的N-乙基-马来酰亚胺的示例性反应混合物中mcMMAF的摩尔分数，以实现在蛋白G上固定和用过量三(2-羧基乙基)膦充分还原的鼠IgGl上选择药物加载。图3.本图提供抗体药物偶联物的样品PLRP色谱图，显示抗体重链和轻链上mcMMAF和NEM的分布。药物的疏水性造成有更多药物种类的保留时间更晚；指示每个种类的药物数目。图4.本图显示药物-Alexa Fluor 647偶联物的荧光输出作为荧光团加载函数。每个抗体的荧光团数目在X轴和荧光团在I轴作图。当每个抗体加载约2. 5-3个荧光团时，荧光快速增加到最大值，然后随着进一步加载而下降。 图5.本图提供650nm与280nm吸光度的比率作为混合的荧光团-mcMMAF抗体偶联物中Alexa Fluor 647加载水平的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·莱昂，D·本杰明，M·瑞安，
申请(专利权)人：西雅图基因公司，
类型：
国别省市：