本发明专利技术提供了使用基于序列的分析和合理的策略来修饰且改善免疫结合剂，特别是单链抗体（scFv）的结构和生物物理学性质（包括性质如稳定性、溶解性和/或抗原结合亲和力）的方法。本发明专利技术提供了通过在经由分析所选择的稳定scFv序列的数据库鉴定的氨基酸位置处进行一个或多个置换而改造免疫结合剂，特别是scFv的方法，其中用于置换的优选氨基酸残基已得到鉴定。本发明专利技术还提供了根据本发明专利技术的改造方法制备的免疫结合剂。本发明专利技术还提供了CDR序列可以插入其内的优选的scFv构架支架，以及使用这些优选的构架支架制备的scFv抗体。
【技术实现步骤摘要】
修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体本申请是申请日为2008年6月25日、专利技术名称为“修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体”、申请号为200880021889. 4的申请的分案申请。本申请要求于2007年6月25日提交的美国临时申请序列号60/937，112的优先权，所述美国临时申请的名称为 “Sequence Based Engineering and Optimization ofSingle Chain Antibodies”。本申请还要求于2008年3月12日提交的美国临时申请序列号61/069，056的优先权,所述美国临时申请的名称为“Methods of Modifying Antibodies,and Modified Antibodies with Improved Functional Properties，，。专利技术背景 已证明抗体在癌症、自身免疫疾病和其他病症的治疗中是非常有效和成功的治疗齐U。尽管一般已在临床上使用全长抗体，但存在使用抗体片段可以提供的许多优点，例如增加组织穿透力、与增加其他效应子功能的能力结合的Fe效应子功能的不存在、和由较短的全身体内半衰期导致的较少全身性副作用的可能性。抗体片段的药代动力学性质表明，它们可能特别良好地适合于局部治疗方法。此外，抗体片段在特定表达系统中可以比全长抗体更容易产生。一个类型的抗体片段是单链抗体(scFv)，其由经由接头序列缀合的轻链可变结构域(')与重链可变结构域(Vh)组成。因此，scFv缺乏所有抗体恒定区结构域，并且先前的可变/恒定结构域界面的氨基酸残基(界面残基)变成溶剂暴露的。scFv可以通过已建立的重组改造技术由全长抗体(例如IgG分子)制备。然而，全长抗体转变成scFv通常导致蛋白质的弱稳定性和溶解性、低产量和高聚集趋势，这增加免疫原性危险。因此，已尝试改善scFv的性质例如溶解性和稳定性。例如,Nieba,L.等人(Prot.Eng. (1997) 10 =435-444)选择已知为界面残基的3个氨基酸残基且使其突变。他们观察到突变的scFv在细菌中周质表达增加，以及热诱导聚集速率减小，尽管热力学稳定性和溶解性未显著改变。其中对scFv内的特定氨基酸残基执行定点诱变的其他研究也已得到报告(参见例如，Tan，P. H.等人(1988) Biophys. J. 75 1473-1482 ；WftriIjA.和 Pluckthun,A. (1998) Biochem. 37 13120-13127 ； Worn, A.和 Pliickthun，A. (1999) Biochem. 38 8739-8750)。在这些各种研究中，选择用于诱变的氨基酸残基基于其在scFv结构内的已知位置(例如，来自分子建模研究)进行选择。在另一种方法中，将来自表达极弱的scFv的互补决定区(⑶R)移植到已证实具有有利性质的 scFv 的构架区内(Jung, S.和 Pliickthun, A. (1997) Prot. Eng. 10 :959_966)。所得到的scFv显示改善的可溶性表达和热力学稳定性。改造scFv以改善功能性质中的进展在例如'Viini , Α.和Pliickthun，A. (2001)J. Mol. Biol. 305 :989-1010中综述。然而，仍需要允许合理设计具有优良功能性质的scFv的新方法，特别是帮助技术人员选择潜在有问题的氨基酸残基用于改造的方法。此外，仍需要改造scFv和其他类型抗体从而赋予改善的功能性质，例如增加的稳定性和/或溶解性性质的方法。专利技术概述本专利技术提供了基于稳定、可溶SCFv构架的序列分析改造免疫结合剂例如SCFv抗体的方法，所述序列分析允许鉴定在scFv序列内对于稳定性和/或溶解性潜在有问题的氨基酸和鉴定在此种氨基酸位置处优选的氨基酸残基置换。因此，依照本专利技术的方法鉴定的氨基酸残基可以选择用于突变，并且可以制备已突变的改造的免疫结合剂例如scFv，且就改善的功能性质例如稳定性和/或溶解性进行筛选。本专利技术提供“功能共有区"(functionalconsensus)方法且证实其优点,其基于功能性选择的(functionally_selected)scFv序列数据库的使用，鉴定scFv构架内的优选氨基酸置换。因此，本专利技术提供了改造免疫结合剂(例如scFv)的 方法，其通过使特定构架氨基酸位置突变成使用本文描述的“功能共有区”方法鉴定的特定氨基酸残基。再进一步地，本专利技术提供了基于本文描述的“功能共有区”方法设计的scFv构架支架，其可以用作目的CDR序列可以插入其内以制备针对靶目的抗原的免疫结合剂例如scFv的构架序列。优选地，在本专利技术的改造方法中使用或由本专利技术的改造方法产生的免疫结合剂是scFv，但其他免疫结合剂例如全长免疫球蛋白、Fab片段、单结构域抗体(例如Dab)和纳米抗体也可以根据本专利技术的方法进行改造。本专利技术还包含了根据改造方法制备的免疫结合齐U，以及包含所述免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。在一个方面，本专利技术提供了改造免疫结合剂的方法，所述免疫结合剂包含(i )重链可变区或其片段，所述重链可变区包含Vh构架残基，和/或(ii )轻链可变区或其片段，所述轻链可变区包含\构架残基，所述方法包括A)选择在Vh构架残基、' 构架残基或Vh和\构架残基内的一个或多个氨基酸位置用于突变；和B)使选择用于突变的一个或多个氨基酸位置突变，其中选择用于突变的一个或多个氨基酸位置和在所选择的一个或多个位置处插入的一个或多个氨基酸残基在下文进一步详细描述。下文描述的氨基酸位置编号使用AHo编号系统；使用Kabat编号系统的对应位置在本文中进一步描述，并且关于AHo和Kabat编号系统的换算表在实施例I中阐述。使用标准单字母缩写编码阐述氨基酸残基。在一个实施方案中，其中如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在重链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换(a)在氨基酸位置I处的Q或E ;(b)在氨基酸位置6处的Q或E ;(c)在氨基酸位置7处的T、S或A，更优选T或A，更加优选T ；(d)在氨基酸位置10处的A、T、P、V或D，更优选T、P、V或D ;(e)在氨基酸位置12处的L或V，更优选L ;(f)在氨基酸位置13处的V、R、Q、M或K，更优选V、R、Q或M ;(g)在氨基酸位置14处的R、M、E、Q或K，更优选R、M、E或Q，更加优选R或E ;(h)在氨基酸位置19处的L或V，更优选L ；(i )在氨基酸位置20处的R、T、K或N，更优选R、T或N，更加优选N ；(j)在氨基酸位置21处的I、F、L或V，更优选I、F或L，更加优选I或L ;(k)在氨基酸位置45处的R或K，更优选K;(I)在氨基酸位置47处的T、P、V、A或R，更优选T、P、V或R，更加优选R ；(m)在氨基酸位置50处的K、Q、H或E，更优选K、H或E，更加优选K ；(η)在氨基酸位置55处的M或I，更优选I ;(ο)在氨基酸位置77处的K或R，更优选K ；(P)在氨基酸位置78处的Α、V、L或I，更优选A、L或I，更加优选A ；(q)在氨基酸位置82处的E、R、T或Α，更优选Ε、Τ或Α，更加本文档来自技高网...
【技术保护点】
改造免疫结合剂的方法，所述免疫结合剂包含（i）重链可变区或其片段，所述重链可变区包含VH构架残基，和/或（ii）轻链可变区或其片段，所述轻链可变区包含VL构架残基，所述方法包括：A）选择在所述VH构架残基、VL构架残基或VH和VL构架残基内的一个或多个氨基酸位置用于突变；和B）使选择用于突变的所述一个或多个氨基酸位置突变，a）其中如果选择用于突变的所述一个或多个氨基酸位置在重链可变区，那么所述突变包括选自下述的一个或多个置换：（a）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置1处的谷氨酸（E）或谷氨酰胺（Q）；（b）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置6处的谷氨酸（E）或谷氨酰胺（Q）；（c）使用AHo或Kabat编号系统的氨基酸位置7处的苏氨酸（T）、丝氨酸（S）或丙氨酸（A）；（d）使用AHo编号系统的氨基酸位置10（使用Kabat编号系统的氨基酸位置9）处的丙氨酸（A）、苏氨酸（T）、脯氨酸（P）、缬氨酸（V）或天冬氨酸（D）；（e）使用AHo编号系统的氨基酸位置12（使用Kabat编号系统的氨基酸位置11）处的亮氨酸（L）或缬氨酸（V）；（f）使用AHo编号系统的氨基酸位置13（使用Kabat编号系统的氨基酸位置12）处的缬氨酸（V）、精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）、甲硫氨酸（M）或赖氨酸（K）；（g）使用AHo编号系统的氨基酸位置14（使用Kabat编号系统的氨基酸位置13）处的精氨酸（R）、甲硫氨酸（M）、谷氨酸（E）、谷氨酰胺（Q）或赖氨酸（K）；（h）使用AHo编号系统的氨基酸位置19（使用Kabat编号系统的氨基酸位置18）处的亮氨酸（L）或缬氨酸（V）；（i）使用AHo编号系统的氨基酸位置20（使用Kabat编号系统的氨基酸位置19）处的精氨酸（R）、苏氨酸（T）、赖氨酸（K）或天冬酰胺（N）；（j）使用AHo编号系统的氨基酸位置21（使用Kabat编号系统的氨基酸位置20）处的异亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）、亮氨酸（L）或缬氨酸（V）；（k）使用AHo编号系统的氨基酸位置45（使用Kabat编号系统的氨基酸位置38）处的精氨酸（R）或赖氨酸（K）；（l）使用AHo编号系统的氨基酸位置47（使用Kabat编号系统的氨基酸位置40）处的苏氨酸（T）、脯氨酸（P）、缬氨酸（V）、丙氨酸（A）或精氨酸（R）；（m）使用AHo编号系统的氨基酸位置50（使用Kabat编号系统的氨基酸位置43）处的赖氨酸（K）、谷氨酰胺（Q）、组氨酸（H）或谷氨酸（E）；（n）使用AHo编号的氨基酸位置55（使用Kabat编号的氨基酸位置48）处的甲硫氨酸（M）或异亮氨酸（I）；（o）使用AHo编号的氨基酸位置77（使用Kabat编号的氨基酸位置66）处的赖氨酸（K）或精氨酸（R）；（p）使用AHo编号系统的氨基酸位置78（使用Kabat编号系统的氨基酸位置67）处的丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或异亮氨酸（I）；（q）使用AHo编号系统的氨基酸位置82（使用Kabat编号系统的氨基酸位置71）处的谷氨酸（E）、精氨酸（R）、苏氨酸（T）或丙氨酸（A）；（r）使用AHo编号系统的氨基酸位置86（使用Kabat编号系统的氨基酸位置75）处的苏氨酸（T）、丝氨酸（S）、异亮氨酸（I）或亮氨酸（L）；（s）使用AHo编号系统的氨基酸位置87（使用Kabat编号系统的氨基酸位置76）处的天冬氨酸（D）、丝氨酸（S）、天冬酰胺（N） 或甘氨酸（G）；（t）使用AHo编号系统的氨基酸位置89（使用Kabat编号系统的氨基酸位置78）处的丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）或苯丙氨酸（F）；（u）使用AHo编号系统的氨基酸位置90（使用Kabat编号系统的氨基酸位置79）处的苯丙氨酸（F）、丝氨酸（S）、组氨酸（H）、天冬氨酸（D）或酪氨酸（Y）；（v）使用AHo编号系统的氨基酸位置92（使用Kabat编号系统的氨基酸位置81）处的天冬氨酸（D）、谷氨酰胺（Q）或谷氨酸（E）；（w）使用AHo编号系统的氨基酸位置95（使用Kabat编号系统的氨基酸位置82b）处的甘氨酸（G）、天冬酰胺（N）、苏氨酸（T）或丝氨酸（S）；（x）使用AHo编号的氨基酸位置98（使用Kabat编号的氨基酸位置84）处的苏氨酸（T）、丙氨酸（A）、脯氨酸（P）、苯丙氨酸（F）或丝氨酸（S）；（y）使用AHo编号系统的氨基酸位置103（使用Kabat编号的氨基酸位置89）处的精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）、缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、甲硫氨酸...
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D·尤里奇，L·博拉斯，
申请(专利权)人：艾斯巴技术，爱尔康生物医药研究装置有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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