修饰的抗-TNFα抗体制造技术

本发明专利技术涉及对人肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）反应性抗体进行修饰，从而导致当用于体内时与任何非修饰的亲代抗体相比基本无免疫原性或具低的免疫原性的抗－ＴＮＦα抗体。本发明专利技术也涉及包含亲代抗体Ｖ－区域中的Ｔ－细胞抗原决定部位的肽分子，该肽分子通过氨基酸改变进行修饰以减少或消除该Ｔ－细胞抗原决定部位。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及尤其是向人施用的且特别是用于治疗用途的多肽。该多肽是修饰的多肽，所述修饰导致该多肽当给予人被试者时具有减少的引起免疫反应的倾向。本专利技术具体地涉及对人肿瘤坏死因子α(TNFα)反应性抗体进行修饰，从而导致当用于体内时与任何非修饰的对应物相比基本无免疫原性或具低的免疫原性的抗-TNFα抗体。
技术介绍
有许多关于治疗性蛋白质的功效受对该治疗性蛋白质有害的免疫反应限制的例子。几种小鼠单克隆抗体已显示出有希望用作许多人类疾病情形的治疗剂，但在某些情况下由于引起显著程度的人抗-鼠抗体(HAMA)反应而失败。对于单克隆抗体已发展了许多技术来试图减少HAMA反应。这些重组DNA方法通常减少最终抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。但是，在几种情况下，结果所得的“人源化”抗体仍然在患者中引起免疫反应。抗体不是唯一一类作为治疗剂给药而可产生免疫反应的多肽分子。即使人来源的且与人体内存在的蛋白质具有相同氨基酸序列的蛋白质也可诱导人体内免疫反应。显著的例子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和干扰素α2等的治疗应用。诱导免疫反应关键的是蛋白质中肽的存在，该肽可通过在II型MHC分子上呈递而刺激T-细胞的活性，即所谓的“T-细胞抗原决定部位”。这种T-细胞抗原决定部位通常定义为具有与II型MHC分子结合的能力的任何氨基酸残基序列。“T-细胞抗原决定部位”含蓄地指如下抗原决定部位，该抗原决定部位当与MHC分子结合时可由T细胞受体(TCR)识别，且至少在原则上可通过与TCR啮合导致这些T-细胞活化以促进T-细胞反应。II型MHC分子是一组在辅助T-细胞的选择和活化中起重要作用的高度多态的蛋白质。人类DR类白细胞抗原(HLA-DR)是该组蛋白质的主要同种型，然而同种型HLA-DQ和HLA-DP也发挥相似的功能。本专利技术可应用于对呈递在DR、DP或DQII型MHC环境中的T-细胞抗原决定部位的检测。在人类群体中，每个个体携带2-4个DR等位基因、2个DQ和2个DP等位基因。许多DR分子的结构已得到了解析，这些结构显示为具有许多疏水口袋的开放式(open-ended)肽结合沟，该疏水口袋与肽的疏水残基(口袋残基)结合。确定不同II型MHC分子同种异型的多态性造成了肽结合沟中多种多样的不同肽结合表面，且在群体水平上确保了能够最大的灵活度地识别外源蛋白质及对病原体生物产生免疫反应。对治疗性蛋白质的免疫反应通过II型MHC肽呈递途径进行。在此，外源蛋白质被吞入并经加工以与DR、DQ或DP类的II型MHC分子结合进行呈递。II型MHC分子是由专业的抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞和树突细胞等表达的。II型MHC肽复合物与T-细胞表面上关连T-细胞受体的结合，加上某些其他共同受体如CD4分子的交互结合可诱导T-细胞内的活化状态。该活化导致细胞因子的释放，从而进一步活化其他淋巴细胞如B细胞以产生抗体，或者活化T杀伤细胞而形成完全的细胞免疫反应。T-细胞抗原决定部位的鉴定是抗原决定部位消除的第一步，然而在本领域中几乎没有清楚的案例将鉴定抗原决定部位和去除抗原决定部位整合在单个方案中。WO98/52976和WO00/34317讲授了鉴定多肽序列的计算穿线(computational threading approach)方法，该多肽序列具有与人II型MHC DR同种异型亚型结合的潜力。在这些讲授中，预测的T-细胞抗原决定部位通过在目的蛋白质中应用合理的氨基酸替代而去除。然而利用该方案和其他鉴定抗原决定部位的基于计算的程序，预测能够与II型MHC分子结合的肽可能并不会在所有情况下，特别是在体内(由于加工途径或其他现象)发挥T-细胞抗原决定部位的功能。此外，这些预测T-细胞抗原决定部位的计算方法通常不能够预测具有DP或DQ限制性的抗原决定部位。除计算技术之外，存在测量合成的肽与II型MHC分子结合能力的体外方法。一种示例性的方法应用具有限定的MHC同种异型的B-细胞系作为II型MHC结合表面的来源，且可应用于II型MHC配体的鉴定中。然而，这种技术不适用于筛选可针对广泛多样的MHC同种异型的多重潜在抗原决定部位，且它们也不能证实结合的肽能否发挥T-细胞抗原决定部位的功能。最近采用重组MHC分子与合成的肽的可溶性复合物的技术已得到应用。这些试剂和方法可用于鉴定来自人或实验动物被试者的外周血液样品中是否存在能够结合特定的MHC-肽复合物的T-细胞克隆，但这些方法和试剂也不适用于筛选可针对广泛多样的MHC同种异型的多重潜在抗原决定部位。T-细胞活化的生物学测定法可提供实际的选择方案，通过该方案可读出所检测的肽/蛋白质序列引起免疫反应的能力。该类方法的例子包括Petra等人的工作，该工作对细菌蛋白质葡萄球菌激酶应用T-细胞增殖测定，随后用合成的肽刺激T-细胞系以对抗原决定部位进行作图。类似地，应用合成的破伤风毒素蛋白质的肽进行的T-细胞增殖测定导致对毒素中免疫优势抗原决定部位的确定。WO99/53038公开了所测试蛋白质的T-细胞抗原决定部位可用分离的人免疫细胞亚群进行确定的方法，其中细胞分离后，促进其在体外分化并在合成的目的肽存在时进行细胞培养，在培养的T-细胞中对任何诱导的增殖进行测量。相同技术也由Stickler等人描述，其中在两种情况下该方法应用于在细菌枯草杆菌蛋白酶中探测T-细胞抗原决定部位。这种技术需要仔细地应用细胞分离技术和利用多种细胞因子补充物进行细胞培养以便获得想要的免疫细胞亚群(树突细胞、CD4+和/或CD8+T-细胞)，且不利于应用多个供体样品的快速通量筛选。如上所述，由此期望从给定的原则上有治疗价值但最初为免疫原性的肽、多肽或蛋白质中鉴定并去除或至少减少T-细胞抗原决定部位。这种治疗上有价值的分子之一是对肿瘤坏死因子α(TNFα)具有结合特异性的单克隆抗体。本专利技术优选的单克隆抗体是描述于美国专利号6,284,471中的抗体cA2的修饰形式。在此处将抗体cA2称为本专利技术的“亲代”抗体。本专利技术的一个目的是提供对人TNFα具有结合特异性的亲代鼠源单克隆抗体的修饰形式，该修饰形式去除了一个或多个T细胞抗原决定部位。TNFα参与介导许多病理学状况，如Crohn氏病、类风湿关节炎和内毒素性或心血管性休克。本专利技术修饰的抗体预期可在这些病症和TNFα作为病理生理学的显著成分的其他疾病中具有治疗用途。cA2抗体不是对TNFα具有结合特异性的唯一抗体。各种具有类似特异性的多克隆和单克隆抗体制品是本领域中公知的。例子包括公开于EP0212489、EP0218868、EP0288088和WO91/02078中的抗-TNFα制品。对重组人TNFα特异的啮齿动物或鼠类单克隆抗体的其它例子已描述于文献中。这些抗体的一些能够在体外中和TNFα的作用并已用于发展对TNFα的免疫测定或用于重组TNFα的纯化。通常，但与抗体cA2相反，这些抗体尚未被开发用于人体内实施诊断和治疗。然而已用鼠抗-TNFα抗体在人被试者中进行了临床研究。在14个接受了单一剂量的鼠抗-TNFα抗体的严重脓毒性休克患者中，7个由于治疗性鼠抗体的免疫原性而对治疗物产生了人抗-鼠抗体反应。。这种免疫原性可使得正在接受鼠抗-TNFα抗体的诊断或治疗的患者中的治本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰的单克隆抗－ＴＮＦα抗体，该抗体当体内应用时与具有基本相同的生物学特异性的任何非修饰的抗体相比基本无免疫原性或有低的免疫原性，且与非修饰的亲代抗体相比在重链和／或轻链Ｖ－区中包含特定氨基酸残基的改变，其中该改变导致在所述Ｖ－区中可以在亲代抗体中充当Ⅱ型ＭＨＣ结合配体并刺激Ｔ－细胞的肽序列的数目减少或消除。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：K海伦多尔恩，M贝克尔，FJ卡尔，
申请(专利权)人：默克专利有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]