抗体片段修饰的微梁制备方法和基于抗体片段修饰的微梁免疫传感检测系统技术方案

本发明专利技术提供了一种抗体片段修饰的微悬臂梁，其镀金表面上定向固定有半抗体片段或抗体的Fab’片段，提高了基于表面应力效应的微悬臂梁免疫检测方法的灵敏度。本发明专利技术还公开了所述微悬臂梁的制备方法、基于所述抗体片段修饰的微悬臂梁的免疫传感检测系统和检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体片段修饰的微悬臂梁(以下也简称为微梁)，及其制备方法。本专利技术还公开了基于所述抗体片段修饰的微梁的免疫传感检测系统和检测方法，所述系统和方法可应用于食品安全、环境污染、生物医学、科学研究和生产制造等领域的监控和检测。
技术介绍
免疫传感技术的原理是基于检测抗原抗体的特异性配对反应，即针对需要检测的某种靶标分子(抗原)，通过生物免疫(把抗原注入小动物体内产生的)方法,产生出相应的探针分子(抗体)，提取、纯化出这种探针分子，再利用抗原抗体的特异性结合去检测样品中的靶分子。已有的免疫传感技术如酶联免疫吸附试验(ELISA，原理是利用抗原与抗体的特异性反应与酶标的催化放大来进行)和免疫荧光法(IF，原理是用荧光片段标记抗 原或抗体)，均需要标记物来示踪抗原抗体的反应结果，就是说仅有抗体，并不能建立相应的检测方法，还需要有酶标物或荧光标记物或蛋白复合物。而一些难制备的靶标分子的标记物价格昂贵，或几乎不可能制备或购买。同时酶联免疫试剂盒和蛋白芯片的检测从原理操作上都要求每一步反应完后进行清洗，标记过程繁琐耗时，是事后的检测，不能实时，原位、在线的检测。基于表面应力检测的微悬臂梁免疫传感技术是近年出现的一种新的免疫生化传感方法，其原理是把探针(抗原或抗体)分子用直接或间接的方式固定(修饰)到微梁一侧的镀金层上，当被检测样品液中的靶分子与微梁金表面上的探针分子发生免疫生化反应时，会使微梁表面应力改变，从而导致微梁弯曲变形，通过光学或电学方法检测这种变形的过程，可得到免疫生化反应的实时信息。基于免疫特异性识别建立的微梁免疫传感技术与传统的需要标记物的免疫传感方法相比，它无需使用任何酶标、荧光物质和放射性作为反应示踪剂，消除了标记过程的影响，灵敏度高(比酶联免疫试验高数倍)，还可以通过监测微梁变形来实时、定量的监测抗原抗体的反应过程，得到更丰富的免疫生化反应的信息。经过这些年的发展，微梁传感被作为一种新兴技术，在生物工程和环境污染监测技术等方面与传统的方法进行对比研究，如RNA转录因子、酶、汞排放及挥发性化合物等，优于常规的酶联免疫方法。但即使如此，微悬臂梁免疫传感技术的检测灵敏度还不足以在成本方面获得相对于常规酶联免疫法的巨大优势，即如果微悬臂梁免疫传感技术的灵敏度或检测极限只比酶联免疫法高数倍，而微悬臂梁免疫传感技术的设备成本与酶联免疫相对较高，使得微悬臂梁免疫传感技术难以商业化。目前，国内外文献报道的方法主要是利用具有双功能基团的疏基化试剂的疏基(-SH)抓住微梁表面的金表面，和另一功能团抓住抗体，实现抗体在微梁镀金层上的固定。例如先将巯基化试剂11-羧酸硫醇结合到微梁的金表面，活化其上的羧基，使之与抗体上的氨基结合来固定抗体(图2)。或用一种巯基化试剂盐酸硫醇亚胺，通过与抗体反应，使抗体连接一个带巯基的分子基团，再通过这个巯基将抗体联结到微梁的金表面上(中国专利CN101407548)(见图3)。这些方法固定抗体，存在如下共同的问题，(I)Y字形抗体(见图I)的Fe段或Fab段的顶端部，会等概率的被固定在金表面上(见图2、3)，没有方向性。而当Fab段的顶端被固定在金表面上时，结合位点被遮挡，限制了抗体的抗原结合位点与抗原的充分结合，从而降低了微梁传感灵敏度；(2)抗体与微梁之间存在不同数目C原子的单链分子，降低了抗原抗体反应产生的应力传递到梁上的效率。由此可见，中国专利CN101407548中公开的方法的灵敏度与酶联免疫法相比仅提高数倍，还无法达到商业化或用于极微量被分析物的检测。因此，在本领域中存在着改进微梁表面与抗体的结合和设计从而进一步提高微梁免疫传感灵敏度和效率的需求。
技术实现思路
综上所述，在已有的微梁免疫传感技术报道中，最突出的问题就是检测灵敏度。影响微梁免疫传感器灵敏度的因素主要有三个方面①抗体的灵敏度(或抗体与抗原结合的亲和性)、②微梁上抗体的固定方法和③微梁的设计与信号读出。由于抗体的灵敏度和微梁的规格与信号读出方式在微梁免疫传感器系统成型之后就无法改变，唯一可变的是微梁表面抗体的固定方法。一种合适的微梁表面抗体的修饰方法，能使固定在微梁表面的抗体与样品溶液中的抗原充分结合，并能高效地将抗原抗体结合所产生的应力变化传递到微梁表面。抗体在微梁表面固定的方向性、密度、活性以及抗体与微梁表面之间的联接分子的长度与刚性都有可能影响最终检测的灵敏度。鉴于现有技术中存在的问题，本专利技术用于解决上述问题的技术方案是通过I)减少抗体分子结合位点以外的抗体分子质量和体积，2)取消使用连接微梁镀金表面与抗体分子的过渡分子层(巯基化试剂)，3)提供一种制备镀金表面上定向固定有抗体片段的微梁的方法，达到提高微梁免疫检测方法的灵敏度目的。抗体Ig分子的结构示意图如图1，包括两个相同的抗原结合片段(Fab)和一个可结晶片段(Fe), Fab和Fe通过中间的铰链区连接,构成Y字形结构。Fab的顶端为与抗原分子的结合位点。在免疫球蛋白抗体分子的“Y”字形四肽链结构(图I)中，由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链以二硫键连接而成。对于Fe段修饰在微梁的镀金表面上时(抗体修饰的定向性好)，抗体对称(Fab段)的两个上端部抗原结合位点与抗原结合后产生的应力，通过抗体Y字型的腿部(Fe段)传递到镀金微梁表面。抗体(IgG)的分子量约150kDa，如果被检测的抗原分子分子量为数百Da，抗体抗原质量比近1000。参与抗原分子结合的位点由重链和轻链的高变区(VH和VL)构成，其与抗原分子的质量比约150，而抗体分子上不参加与抗原分子结合的Fe段，其与抗原分子的质量比近400。因此我们设想，如果能够减少结合位点以外的抗体分子质量和体积，保持抗体的结合位点朝向固定表面的外法线方向，就能够提高应力的传递效率和抗体在微梁表面的有效修饰密度，从而提高微梁免疫传感的灵敏度。为此，在第一个方面，本专利技术提供了一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤I)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁；2) 二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所述抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段；3)固定步骤将步骤2)获得的半抗体片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金表面上固定有所述半抗体片段的微悬臂梁。在第二个方面，本专利技术还提供了一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤I)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁；2)酶解步骤用蛋白酶将所述抗体裂解成F(ab’)2片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合；3) 二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所述F(ab’)2片段，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的Fab’片段；4)固定步骤将步骤3)获得的Fab’片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金表面上固定有所述Fab’片段的微悬臂梁。 在第三个方面，本专利技术还提供了一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤I)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁；2) 二硫键还原步骤使用二硫键还原剂处理所抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段；3)酶解步骤用蛋白酶将所述半抗体片段裂解成Fab’片段和多个小分子片段，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合；4)固定步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备微悬臂梁的方法，包括以下步骤：1)提供抗体和带有镀金层的微悬臂梁；2)二硫键还原步骤：使用二硫键还原剂处理所述抗体，使得所述抗体铰链区的二硫键还原成巯基，从而得到两个对称的带有巯基的半抗体片段；3)固定步骤：将步骤2)获得的半抗体片段与镀有金层的微悬臂梁结合，得到镀金表面上固定有所述半抗体片段的微悬臂梁。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张青川，吴尚犬，邬林，伍小平，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：