本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种GLP‑1或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白的制备方法。本发明专利技术提供一种GLP‑1或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：将GLP‑1或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白编码序列克隆至表达载体中；将表达载体转染CHO‑DXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株；将所得细胞表达、纯化后，即得所述融合蛋白。本发明专利技术所提供的制备方法在CHO细胞系DXB11中表达GLP‑1‑Fc分子，不会产生降解问题，后续的纯化得率大大提高，生物学活性并未减弱，非常适合工艺业化生产需求。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种。本专利技术提供一种，包括如下步骤：将GLP-1或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白编码序列克隆至表达载体中；将表达载体转染CHO-DXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株；将所得细胞表达、纯化后，即得所述融合蛋白。本专利技术所提供的制备方法在CHO细胞系DXB11中表达GLP-1-Fc分子，不会产生降解问题，后续的纯化得率大大提高，生物学活性并未减弱，非常适合工艺业化生产需求。【专利说明】GLP-1或其类似物与抗体Fe片段融合蛋白的制备方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种GLP-I或其类似物与抗体Fe片段融合 蛋白的制备方法。
技术介绍
胰高血糖素样肽-I(GLP-I)可促进胰岛素释放，降低血浆中的胰高血糖素水平， 降低胃排空的速率，促进饱食感并刺激胰岛的生物合成和β细胞的增殖，可用于2型糖尿 病的治疗。在我国2型糖尿病发病广泛，如果不及时加以治疗，容易转变成1型糖尿病，给 患者和国家造成很大负担。因此，开发这类药物的需求极为迫切。目前美国礼来公司的艾 塞那肽（百泌达）和丹麦诺和诺德制药公司的利拉鲁肽（诺和力）已经在我国获得进口注 册，两种药物都具有降血糖和减轻体重的作用，但需要每天1-2次皮下注射给药。 为了增加的体内半衰期，使GLP-I长效化从而减少单位时间给药次数已经成为国 内外研究的热点。目前研究的GLP-I及类似物长效化的方法主要有以下三种方式：（I)PEG 化长效，代表为Nove Nordisk公司（丹麦诺和诺德公司）研发的每周一次皮下注射的长效 GLP-I类似物索玛鲁肽；（2)GLP-1与白蛋白融合蛋白，代表为专利CN10665538A ; (3)GLP-1 与抗体的Fe片段融合蛋白，代表为专利CN1802386B。礼来公司的GLP-I-Fc (LY2189265)目 前正在美国三期临床阶段，根据临床实验的数据报道，LY2189265能够有效增加 GLP-I的半 衰期，实现每周给药一次，提高了患者治疗的依从性。 重组人胰高血糖素样肽-I(GLP-I)类似物与具有延长人体内半衰期作用的抗体 Fe片段组成的融合蛋白（简称GLP-I-Fc)，国外制药公司将该融合蛋白应用于人体临床实 验能够有效的治疗2型糖尿病的同时降低体重。 随着抗体技术的发展，许多上市的抗体类药物都是在CHO-S或CHO-Kl细胞为原 始细胞的基础上构建工程细胞，工业生产中采用高密度细胞培养的方法实现抗体目标蛋白 在最终细胞培养液中的高表达。由于抗体分子有分子结构稳定的特点，高密度细胞培养过 程中由于部分工程细胞凋亡而释放出的蛋白酶对抗体目标蛋白影响很小。由于GLP-I-Fc 融合蛋白存在抗体Fe片段作为分子的组成部分，其分子具有一些抗体的特性，很多人认为 CHO-S或CHO-Kl细胞为原始细胞的基础上构建工程细胞也应当是最方便和合理的选择。但 是，在此
的一些信息得到，该融合蛋白在细胞表达阶段会出现不同程度的降解，所 降解的GLP-I-Fc在后续分离纯化制备中很难去除，不但影响到产品的生物学活性也会严 重影响产品制备的得率，其原因在于GLP-I-Fc融合蛋白中N端最关键的GLP-I部分的31个 氨基酸很不稳定，容易被细胞凋亡裂解后释放的蛋白酶的水解作用而降解。Qiao-Zhen Lu 等人在文献Characterization of the Proteases Involved in the N-Terminal Clipping of Glucagon-Like-Peptide-l-Antibody Fusion Proteins 中提到，GLP-l-Fc 在 CHO-S 细 胞系中表达最多会出现超过50%的不完整形态，即降解条带。由于在细胞发酵过程中产生 的N-端出现降解的GLP-I-Fc融合蛋白必须在最终药品的制造过程中有效去除，导致合格 终产品的得率在10% -50%之间。 在同一篇文章中提到细胞培养过程中添加蛋白酶抑制剂（盐酸苯甲脒）控制 降解，但对产品的成药还是增加了风险，在后续的工艺中要对蛋白酶抑制剂进行灭活及 根除也会使得整个产品的制备工艺更加复杂和不经济，而且添加蛋白酶抑制剂只能降低 GLP-I-Fc分子N-端降解的程度，不能有效抑制其发生，不能真正解决降解问题。另一种去 除GLP-I-Fc分子N-端降解产物的方法是使用多种色谱柱层析进行多步骤的纯化，虽然也 能得到非常纯的GLP-I-Fc融合蛋白，但是全过程的产率大大下降至20%以下，大大低于治 疗性抗体药物大于70%的得率水平。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种GLP-I或其类似物与 抗体Fc片段融合蛋白的制备方法，用于解决现有技术中的问题。本专利技术专利技术人将GLP-I-Fc 表达质粒DNA导入不同的哺乳动物细胞系中，惊奇的发现在CHO细胞系DXBll中所表达的 GLP-I-Fc融合蛋白无降解出现，以至于合格终产品的得率大于70%。 为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种GLP-I或其类似物与 抗体Fc片段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤： 1)将GLP-I或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白（GLP-I-Fc)编码序列克隆至表达 载体中； 2)将表达载体转染CHO-DXBl 1细胞，培养并筛选出阳性细胞株； 3)使用步骤2所得细胞表达、纯化后，即得所述融合蛋白。 优选的，所述GLP-I或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白由重组人胰高血糖素样 肽-I (GLP-I)或其类似物通过连接肽与具有延长人体内半衰期作用的抗体Fc片段连接形 成。 更优选的，所述GLP-I或其类似物的氨基酸序列与SEQ ID No. 14 (GLP-1原型序 列）具有80%以上的同源性，更优选的，具有90%以上的同源性，进一步优选为具有97%以 上的同源性。 更优选的，所述GLP-I或其类似物的具体序列如SEQ ID No. 14、SEQ ID No :1或 SEQ ID No : 2 所示。 更优选的，所述连接肽的氨基酸数量为> 2个，所述连接肽由甘氨酸（Gly)和丝氨 酸（Ser)组合而成。 更优选的，所述连接肽的氨基酸数量为6-36个。 更优选的，所述连接肽的氨基酸数量为14-36个。 更优选的，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No :3_8所示。 进一步优选的，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No : 7所示。 更优选的，所述抗体Fc片段为本领域的不具ADCC效应子功能的非裂解性Fc。 进一步优选的，所述抗体Fe片段的氨基酸序列如SEQ ID No :9所示。 在本专利技术的优选实施例中，所述GLP-I或其类似物与抗体Fe片段融合蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID No: 10和SEQ ID No: 11所示；所述GLP-I或其类似物与抗体Fe片段融 合蛋白编码序列如SEQ ID No : 12和SEQ ID No : 13所示。 优选的，所述表达载体选自DHFR系统的表达载体和/或GS系统的表达载体。 进一步优选的，所述DHF本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种GLP‑1或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：1)将GLP‑1或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白编码序列克隆至表达载体中；2)将表达载体转染CHO‑DXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株；3)使用步骤2所得细胞表达、纯化后，即得所述融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许必雄，郭颀然，赵红阳，
申请(专利权)人：上海兴迪金生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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