抗体的Fc段上结合的N-糖苷键型糖链中第297位的Asn上结合的糖链与抗体的活性、血中稳定性相关，但第297位以外的多余糖链可能会给抗体恒定区介导的活性带来影响、或者可能会使作为抗体药物的均一性产生问题。因此，需要一种对抗体的Fc段上结合的N-糖苷键型糖链中EU索引第297位以外的Asn残基上结合的多余糖链进行控制的方法。一种修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其中，对构成存在于人IgG抗体的Fc段的EU索引第297~299位以外的Asn-X-Ser/Thr(X为Pro以外的氨基酸残基)序列的氨基酸残基进行了选自下述氨基酸修饰中的至少一种氨基酸修饰：由Asn修饰成其他氨基酸残基、由X修饰成Pro以及由Ser/Thr修饰成其他氨基酸残基。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗体的Fe段上结合的N-糖苷键型糖链中EU索引第297位以外的Asn残基上结合的糖链减少或缺失的修饰抗体组合物、抗体的Fe段上结合的N-糖苷键型糖链中EU索引第297位以外的Asn残基上结合的多余糖链减少或缺失且抗体的效应活性得到维持的修饰抗体组合物、编码该修饰抗体分子的DNA、生产该 修饰抗体组合物的细胞、制造该修饰抗体组合物的方法以及使抗体的Fe段上结合的N-糖苷键型糖链中EU索引第297位以外的Asn残基上结合的多余糖链减少的方法。
技术介绍
抗体具有高结合活性、结合特异性和血中的高稳定性，因此，一直在尝试应用抗体作为人的各种疾病的诊断、预防和治疗剂(非专利文献I)。另外，已经利用基因重组技术，由非人动物抗体制作出人嵌合抗体或人源化抗体(非专利文献2 5)。人嵌合抗体中，抗体可变区由人以外的动物的抗体构成，恒定区由人抗体构成。人源化抗体是指人以外的动物的抗体的互补决定区(complementarity determiningregion,⑶R ;以下记作CTR)被取代成人抗体的⑶R的抗体。人嵌合抗体和人源化抗体解决了非人动物抗体的免疫原性高、效应功能低、血中半衰期短等小鼠抗体等所具有的问题，从而使单克隆抗体作为药品的应用成为可能(非专利文献6、)。例如，在美国，多种人源化抗体已被批准作为癌治疗用抗体并正在销售(非专利文献10)。上述人嵌合抗体和人源化抗体实际在临床上显示出了某种程度的效果，但需求效果更高的抗体药物也是事实。例如，据报道单独施用作为抗⑶20人嵌合抗体的美罗华(Rituxan，注册商标)(非专利文献11) (IDEC公司/罗氏公司/基因泰克公司)时，在III期临床试验中对复发性低度恶性非霍奇金淋巴瘤患者的有效率仅为48%(完全缓解6%、部分缓解42%)，另外，平均效果持续时间为12个月(非专利文献12)。另外，据报道将美罗华(注册商标)与化学疗法(CHOP :环磷酰胺、多柔比星、长春新碱)并用时，在II期临床试验中对复发性低度恶性和滤泡性非霍奇金淋巴瘤患者的有效率为95% (完全缓解55%、部分缓解45%)，但观察到由CHOP引起的副作用(非专利文献13)。据报道单独施用作为抗HER2人源化抗体的赫赛汀(Here印tin，注册商标)(基因泰克公司)时，在III期临床试验中对转移性乳腺癌患者的有效率仅为15%，平均效果持续时间为9. I个月(非专利文献14)。人抗体分子也称为免疫球蛋白(以下称为Ig)，基于其分子结构而分为IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM 各类。抗体药物主要使用的人IgG(以下称为IgG)型抗体分子由各两条的称为重链(heavy chain,以下称为H链)和轻链(light chain,以下称为L链)的多肽形成。H链从N末端侧起由称为H链可变区(以下记作VH)、CHl、铰链(Hinge)、CH2和CH3的各结构域结构形成。CH1、铰链、CH2和CH3也一并称为重链恒定区(以下记作CH)，CH2和CH3 —并称为Fe段。L链从N末端侧起由称为L链可变区(以下记作VL)、L链恒定区(以下记作CL)的各结构域结构形成。IgG型抗体的H链存在IgGl、IgG2、IgG3和IgG4四个亚类。各IgG亚类的H链的 除富有可变性的铰链以外的恒定区彼此具有约95%的氨基酸序列的同源性。尽管各IgG亚类的氨基酸序列的同源性高，但它们所具有的生物活性的强弱却不同(非专利文献15)。作为生物活性，可以列举补体依赖性细胞毒活性(complement-dependent cytotoxicity, Q)C ;以下简记为Q)C活性)、抗体依赖性细胞毒活性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC ;以下简记为 ADCC 活性)、吞卩遼活性等效应功能，上述生物活性在生物体内对排除异物和病原体发挥着重要的作用。在自然杀伤细胞(以下记作NK细胞)、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞等各种白细胞的表面上表达Fe y受体(以下记作Fe y R)家族。Fe YR 分为 Fe yRI、Fe y RIIa, Fe y RIIIa, Fe y RIIIb 这一类活性型 Fe YR 和Fe y RIIb这一类抑制型Fe y R0 IgG抗体、对于人而言特别是IgGl和IgG3与上述受体发生强结合，结果，诱导出白细胞的ADCC活性和吞噬活性。ADCC活性是指与抗原结合的抗体介由Fe段主要与NK细胞表面的Fe YRIIIa结合、结果因由NK细胞释放的穿孔素、颗粒酶等细胞毒性分子而引起的细胞溶解反应(非专利文献16、17)。ADCC活性一般显示出IgGl > IgG3 >> IgG4彡IgG2的排序(非专利文献18、19)。通过晶体结构分析显示，Fe上的Fe Y RIIIa的结合部位存在于CH2结构域，并且在两个CH2结构域之间结合一分子Fe y RIIIa(非专利文献20)。CDC活性是指与抗原结合的抗体使血清中称为补体系统的一组血清蛋白的级联反应活化并最终使靶细胞溶解的反应。CDC活性在人IgGl和IgG3中较高，一般显示出IgG3彡IgGl >> IgG2 N IgG4的排序。补体系统分为Cf C9各成分，其大部分为经过部分分解而表现出酶活性的酶前体。⑶C活性最初开始于作为Cl的成分之一的Clq与靶细胞上的抗体的Fe段的结合，各成分在前一阶段成分的作用下发生部分分解，由此推进活化的级联反应，最终，C5^C9在靶细胞的细胞膜上形成称为膜攻击复合物的孔形成聚合体，从而引起细胞的溶解反应(非专利文献16、17)。通过Fe段的氨基酸取代研究暗示Clq在Fe段上的结合部位存在于CH2结构域(非专利文献21)。从临床上使用的抗体药物的药效机制方面来看，也认识到上述效应功能的重要性。上述美罗华(注册商标)是IgGl亚类的人嵌合抗体，在体外显示出ADCC活性和CDC活性(非专利文献22)。另外，就美罗华(注册商标)的临床效果而言，对表现ADCC活性强的Fe Y RIIIa基因型的患者的治疗效果高(非专利文献23)，施用后迅速地从血中消耗补体成分(非专利文献24)，并且在施用后复发的患者的癌细胞中作为CDC活性抑制因子的CD59表达增加(非专利文献25)等，由此暗示美罗华(注册商标)实际上在患者体内发挥了效应功能。赫赛汀(注册商标)也是IgGl亚类的人源化抗体，据报道其对表现ADCC活性强的Fe YRIIIa基因型的患者的治疗效果高(非专利文献26)。另外，人IgG通过与血管内皮细胞等上表达的新生儿Fe受体(neonatal Fereceptor for IgG, FcRn ;以下记作FcRn)在内体中的低pH条件下进行结合而避免由溶酶体引起分解，结果，具有长达7天(IgG3r21天(IgGUIgG 2、IgG 4)的血中半衰期。通过Fe的氨基酸残基修饰的研究暗示抗体的Fe与FcRn的结合部位存在于CH2结构域与CH3结构域的界面处(非专利文献27)。·基于以上背景可知，人IgGl抗体与其他亚类相比具有更强的ADCC活性和⑶C活性，而且在人血中的半衰期更长等，因此，最适合作为抗体药物。已知Clq与抗体分子的Fe段结合。Cl本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.02 US 61/309,6311.一种修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其中，对构成存在于人IgG抗体的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X为Pro以外的氨基酸残基)序列的氨基酸残基进行了选自下述氨基酸修饰中的至少ー种氨基酸修饰由Asn修饰成其他氨基酸残基、由X修饰成Pro以及由Ser/Thr修饰成其他氨基酸残基。2.如权利要求I所述的修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其中，存在于人IgG抗体的Fe段的EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X为Pro以外的氨基酸残基)序列中的Asn上附加有N-糖苷键型糖链。3.如权利要求I或2所述的修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其中，存在于EU索引第297 299位以外的Asn-X-Ser/Thr (X为Pro以外的氨基酸残基)序列为EU索引第392 394位。4.如权利要求广3中任一项所述的修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其中，EU索引第392 394位的氨基酸残基中至少ー个氨基酸残基被修饰成以下的氨基酸残基， EU 索引第 392 位Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Asp、Gln、Glu、Lys、Arg、His、Phe、Tyr 或 Trp EU索引第393位=ProEU 索引第 394 位Leu、Asn、Asp、Lys> Phe> Tyr 或 Trp05.如权利要求广4中任一项所述的修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其中，人IgG抗体的Fe段包含序列号I表示的氨基酸序列。6.如权利要求1飞中任一项所述的修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其包含CHl结构域和铰链结构域，并且该CHl结构域和铰链结构域包含人IgGl抗体来源的氨基酸序列。7.如权利要求1飞中任一项所述的修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其包含EU索引第339位的Thr被修饰成Asn或Tyr的氨基酸残基的Fe段。8.如权利要求广7中任一项所述的修饰抗体组合物及该修饰抗体组合物片段，其包含EU索引第397位的Met被修饰成选自Gin、Asn、Asp和Phe中的任意一种氨基酸残基的抗体Fe段。9.ー种DNA，其编码...
【专利技术属性】
技术研发人员：丹羽伦平，土屋摩珠，
申请(专利权)人：协和发酵麒麟株式会社，
类型：发明
国别省市：
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