马克斯克鲁维酵母来源的高表达启动子制造技术

本发明专利技术提供作为马克斯克鲁维酵母来源的新型高表达启动子的GAL1启动子、包含该高表达启动子的重组多核苷酸、包含该重组多核苷酸的载体、通过将该重组多核苷酸或该载体导入酵母中而得到的转化体、使用该转化体的目的基因的高表达方法、使用该转化体的目的基因产物的制造方法。特征在于利用本发明专利技术的高表达启动子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)来源的新型高表达启动子、包含该启动子的重组多核苷酸、包含该重组多核苷酸的载体、通过将该重组多核苷酸或该载体导入酵母中而得到的转化体、使用该转化体的目的基因的高表达方法、使用该转化体的目的基因产物的制造方法。
技术介绍
随着近年来基因重组技术的进展，能够使用大肠杆菌等微生物进行各种有用蛋白质的生产。但是，已知使真核生物来源的异种蛋白质基因以大肠杆菌作为宿主进行表达时，存在无法进行正常的加工或糖链的添加等翻译后的正常修饰的问题。因此，作为真核生物的酵母较多用作宿主。作为宿主酵母，已知有例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等(例如参考专利文献I)。但是，异种蛋白质在作为宿主的酵母中的表达量仍有改善的余地。使异种蛋白质基因在宿主中进行表达时，将以能够使该异种蛋白质基因在可在宿主内发挥作用的启动子的调控下工作的方式配置的重组多核苷酸导入宿主内，使该异种蛋白质在该转化体内表达。启动子的转录活性很大程度上决定异种蛋白质的表达效率，因此，通常使用转录活性高的启动子。另外，优选在所期望的时机诱导异种蛋白质基因的表达。这是因为，在利用转化体进行的发酵生产中，如果首先使转化体尽可能多地增殖、然后使其表达该异种蛋白质，则该异种蛋白质的生成效率提高。作为转录活性高且能够进行诱导的启动子，公知有半乳糖诱导型启动子。半乳糖诱导型启动子是在缺乏葡萄糖时受半乳糖诱导的启动子，在酿酒酵母等中，经常使用GALl启动子、GAL2启动子、GAL3启动子、GAL5启动子、GAL7启动子、GALlO启动子等半乳糖代谢基因(GAL基因)的启动子(GAL启动子)(例如参考专利文献2)。另外，马克斯克鲁维酵母为耐热性酵母(例如非专利文献I和2)。利用普通的酵母进行乙醇发酵时，发酵液的温度因发酵热而上升，因此，为了持续进行乙醇发酵，必须对发酵液进行冷却。因此，在工业上进行乙醇发酵时，大规模的冷却设备和该冷却所需要的巨大的能量成本是必不可缺的。但是，马克斯克鲁维酵母即使在48°C的高温下也能够进行增殖(非专利文献3和4)，因此，能够高效地进行乙醇发酵而不需要上述冷却设备和能量成本。目前尚未获知该马克斯克鲁维酵母的GAL启动子的序列。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2008-29239号公报专利文献2 :日本特开2007-89512号公报非专利文献非专利文献 I :Bioresource Technology (2007) 98, 3367-3374非专利文献 2 Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79，339-354非专利文献3 :Applied and Environmental Microbiology (2008) 74, 7514-7521非专利文献4 :Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010)85, 861-86
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于提供作为马克斯克鲁维酵母来源的新型高表达启动子的GALl启动子、包含该高表达启动子的重组多核苷酸、包含该重组多核苷酸的载体、通过将该重组多核苷酸或该载体导入酵母中而得到的转化体、使用该转化体的目的基因的高表达方法、使用该转化体的目的基因产物的制造方法。 用于解决问题的方法本专利技术人进行了深入研究，结果成功地从马克斯克鲁维酵母中分离出GALl启动子，并且发现，该启动子能够使目的基因在马克斯克鲁维酵母中显著地进行高表达，而且还能够使目的基因在酿酒酵母中进行高表达，从而完成了本专利技术。S卩，本专利技术涉及(I) 一种高表达启动子，其包含下述中的任意一种多核苷酸(a)序列号I表不的多核苷酸；(b)与上述(a)的多核苷酸具有80%以上的同一丨I生并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸；(c)序列号2表不的多核苷酸；(d)与上述(c)的多核苷酸具有80%以上的同一丨I生并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸；(e)序列号3表不的多核苷酸；以及(f)与上述(e)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸。另外，本专利技术涉及(2) —种重组多核苷酸，其包含上述(I)所述的高表达启动子和以能够在该启动子的调控下工作的方式配置的目的基因。此外，本专利技术涉及(3) —种载体，其包含上述⑵所述的重组多核苷酸。另外，本专利技术涉及(4) 一种转化体，其特征在于，通过将上述(2)所述的重组多核苷酸或上述(3)所述的载体导入酵母中而得到；(5)如上述(4)所述的转化体，其特征在于，酵母为选自由酵母属(Saccharomyces)酵母和克鲁维酵母属(Kluveromyces)酵母组成的组中的任意一种酵母；(6)如上述(4)所述的转化体，其特征在于，酵母为选自酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母中的任意一种酵母。此外，本专利技术涉及(7) —种目的基因的高表达方法，其特征在于，包括对上述(4广(6)中任一项所述的转化体进行培养的步骤。另外，本专利技术涉及(8) —种目的基因产物的制造方法，其特征在于，包括对上述(4广(6)中任一项所述的转化体进行培养的步骤和从培养得到的转化体中回收目的基因产物的步骤。专利技术效果本专利技术的高表达启动子不仅能够使目的基因在马克斯克鲁维酵母中进行高表达，而且还能够使目的基因在其他酵母中进行高表达。例如，在酿酒酵母中使用本专利技术的高表达启动子时，与酿酒酵母的GALlO启动子相比，更能够使目的基因进行高表达。因此，使用本专利技术的高表达启动子时，还能够高效地制造目的基因产物。附图说明图I是表示马克斯克鲁维酵母的GALl启动子、GALlO启动子、GAL7启动子的启动子结构的图。图2是表示马克斯克鲁维酵母的GALl启动子(KmGALl启动子)的启动子结构的图。图3是表示用于确定KmGALl启动子的位置的表达分析试验的结果的图。图4是表示马克斯克鲁维酵母或酿酒酵母的KmGALl启动子的表达分析试验的结果的图。 具体实施例方式I.本专利技术的启动子本专利技术的高表达启动子的特征在于，(A)包含序列号1、2或3表示的多核苷酸，或者，(B)包含作为上述多核苷酸的突变体并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸。序列号I表示的多核苷酸为马克斯克鲁维酵母来源的GALl启动子，序列号2表示的多核苷酸为马克斯克鲁维酵母来源的GAL7启动子，序列号3表示的多核苷酸为马克斯克鲁维酵母来源的GALlO启动子。该本专利技术的高表达启动子不仅能够使目的基因在马克斯克鲁维酵母中进行高表达，而且还能够使目的基因在其他酵母中进行闻表达。作为上述(B)的、包含作为序列号1、2或3表示的多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.09 JP 2010-0266821.一种高表达启动子，其包含下述(a广(f)中的任意一种多核苷酸 (a)序列号I表不的多核苷酸； (b)与上述(a)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸； (c)序列号2表不的多核苷酸； (d)与上述(c)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸； (e)序列号3表不的多核苷酸；以及 (f)与上述(e)的多核苷酸具有80%以上的同一性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启动子活性的多核苷酸。2.一种重组多核苷酸，其包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：赤田伦治，星田尚司，井手政充，
申请(专利权)人：国立大学法人山口大学，
类型：发明
国别省市：