细胞培养方法和使用其的细胞培养装置制造方法及图纸

提供能够对包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的BBB模型进行量产的细胞培养方法和使用其的细胞培养装置，以及可提高其量产性的细胞培养方法。本发明专利技术的细胞培养方法具备：在细胞培养插件的多孔质膜的外表面注入悬浮状态的细胞培养液的工序；在该细胞培养液中接种星形胶质细胞的细胞，对星形胶质细胞进行培养的工序；在上下翻转的细胞培养插件内部接种周细胞的细胞，对周细胞进行培养的工序；在将具有温度敏感性的血管内皮细胞包埋于温度敏感性凝胶的状态下进行接种，对血管内皮细胞进行培养的工序；以及使温度敏感性凝胶溶解的工序。解的工序。解的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞培养方法和使用其的细胞培养装置


[0001]本专利技术涉及在生物体外对构成血脑屏障(Blood
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brain barrier)in vitro(体外)模型(以下称为BBB模型。)的细胞进行培养的技术，特别是涉及能够实现包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的BBB模型的大量生产的细胞培养方法和使用其的细胞培养装置。需说明的是，“in vitro”是拉丁语，意为“在玻璃容器中”，一般表示生物体的一部分被摘出“生物体外”或游离于“生物体外”的状态。

技术介绍

[0002]血脑屏障(BBB)是解剖学上的脑毛细血管，由脑来源的血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞等构成。以围绕血管内皮细胞的方式存在的周细胞具有控制血管内皮细胞的分化、增殖的功能，星形胶质细胞具有向神经细胞供应营养、同时通过迅速将过剩的离子、神经递质除去来保护神经细胞的功能。
[0003]血脑屏障(BBB)具有限制血液与脑组织液之间进行的物质交换的重要功能，通过该功能来维持神经细胞的恒定性。但该功能在开发中枢神经性疾病中使用的预防药物、治疗药物上是一个重大障碍。例如，存在应当作用于中枢神经系统的药物向脑内的移动实际上被BBB阻碍、无法获得期待的效果的情况。此外，还存在本来预想不会向脑内移动的药物与预想相反地穿过BBB、结果对中枢神经系统产生不良影响的情况。
[0004]关于什么样的物质会穿过BBB并没有一定的规律，因此在开发中枢神经性疾病中使用的预防药物、治疗药物时，有必要使用BBB模型进行筛选。
[0005]本申请专利技术人迄今为止已成功开发了准确再现BBB的解剖学结构的模型，由此，目前药物研发中筛选研究的水平有了飞跃性提高。
[0006]该BBB模型呈下述结构：星形胶质细胞和周细胞之间夹持多孔质膜，分别形成层状，同时，以与周细胞直接接触的方式配置层状的血管内皮细胞。需说明的是，该BBB模型以往是通过熟练的研究者的手动操作来制作的，其制作需要特殊的技术，因此存在无法大量生产的问题。
[0007]作为与上述BBB模型的制作相关的技术，例如专利文献1中，公开了名为“细胞培养插件”的、在多孔质膜的两面对细胞进行共培养的装置相关的专利技术。
[0008]专利文献1公开的细胞培养装置的特征在于，具备下端安装有多孔性的膜的外侧管状主体、与该外侧管状主体下端的外径嵌合的辅助管状主体、以及至少1个法兰盘从上端在横向延伸、外径的全周或一部分与外侧管状主体的内径嵌合的悬挂构成要素，在第1阶段，外侧管状主体与辅助管状主体连接而形成用于第1细胞培养的自立式插件，在第2阶段，外侧管状主体从辅助管状主体脱离，同时，为了进行第2细胞培养而安装于悬挂构成要素。
[0009]该细胞培养装置中，将辅助管状主体与外侧管状主体的下端连接后，将两者翻转，从而形成细胞培养室。因此，该细胞培养室中，在向辅助管状主体内突出的膜的外表面上接种细胞(第1细胞接种)。接下来，在经过适当的培养时间的时刻，将外侧管状主体和辅助管状主体的组合体翻回来，将悬挂构成要素与外侧管状主体连接后，将辅助管状主体移除。将
这样操作得到的悬挂插件配置在细胞培养板的孔内，在呈向上方突出状态的膜的内表面上实施第2细胞接种。
[0010]这样，利用上述结构的细胞培养装置，通过对膜的外表面和内表面分两个阶段分别进行细胞接种，能够在膜的两面对细胞进行共培养。
[0011]现有技术文献
[0012]专利文献
[0013]专利文献1：日本特许第5674953号公报

技术实现思路

[0014]专利技术所要解决的课题
[0015]专利文献1公开的专利技术中，虽然能够制作在多孔质膜的两面分别形成有不同种类细胞层的细胞培养模型，但用于形成细胞培养室和悬挂插件的操作必须挨个手动进行操作，因而不适合细胞培养模型的量产。因此认为，即便将专利文献1公开的细胞培养装置应用于BBB模型的制作，也无法对BBB模型进行量产。
[0016]本专利技术的第1目的在于应对这样的现有情况，提供能够对包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的BBB模型进行量产的细胞培养方法和使用其的细胞培养装置。此外，本专利技术的第2目的在于，提供能够通过长时间维持层叠有上述3种细胞的状态来提高包括这些细胞层的BBB模型的量产性的细胞培养方法。
[0017]用于解决课题的方法
[0018]为了实现上述目的，第1专利技术的特征在于，具备细胞培养室，将形成为筒状的内壁被多孔质膜上下划分而成的一对细胞培养室连接多个而使被上下划分的细胞培养室分别一体化，其中，多孔质膜形成为两面可固着生物材料；并且具备细胞培养室盖，其使被划分且被分别一体化的细胞培养室中的至少任一方同时闭塞。
[0019]这样结构的细胞培养装置中，因为具备覆盖细胞培养室的开口端的细胞培养室盖，所以具有无需担忧注入细胞培养室内的细胞培养液、接种的细胞在操作时从细胞培养室漏出的作用。
[0020]需说明的是，之所以设为一对细胞培养室中的至少任一方被细胞培养室盖闭塞的构成，是因为如果最初将包括固着于多孔质膜的上侧(第1面)的生物材料的一个细胞培养室闭塞，将这一细胞培养室翻转而朝向下侧，使另一细胞培养室为上侧，在先前的多孔质膜的背面(第2面)使生物材料固着，然后再翻转，则即使不将两者闭塞，也能够在多孔质膜的两面培养生物材料。
[0021]此外，“使被划分且被分别一体化的前述细胞培养室中的至少任一方同时闭塞”的意思是，除了将被一体化的细胞培养室整体同时闭塞的情况以外，还包括将构成一体化的细胞培养室的各个细胞培养室中的每一个同时闭塞的情况。
[0022]第2专利技术的特征在于，在第1专利技术中，具备：细胞培养板，其具有作为内壁使用的多个第1通孔，同时以覆盖该第1通孔的方式在底面设置有由多孔质膜构成的片；第1底面盖，其上部开口，在底板设有与第1通孔一起作为内壁使用的多个第2通孔，并且设于细胞培养板的底面；以及第2底面盖，其作为细胞培养室盖，设于第1底面盖的底板；第2通孔设置在俯视设于细胞培养板的底面的状态的第1底面盖时与第1通孔匹配的位置。
[0023]第2专利技术中，在第1专利技术的作用的基础上，具有下述作用：如果在将细胞培养板翻转的状态下在底面设置第1底面盖后，在第2通孔内部接种细胞培养液以及星形胶质细胞，则利用第2通孔的内壁，防止细胞培养液和星形胶质细胞的漏出，因此容易利用多孔质膜的外表面培养星形胶质细胞。此外，还具有下述作用：如果将第2底面盖设于第1底面盖，将细胞培养板与第1底面盖和第2底面盖一起翻转后，在细胞培养板的第1通孔内部接种细胞培养液以及周细胞和血管内皮细胞，则利用第1通孔的内壁，防止细胞培养液、周细胞和血管内皮细胞的漏出，因此容易利用多孔质膜的内表面培养周细胞和血管内皮细胞。进一步，设有第1底面盖和第2底面盖的细胞培养板还具有作为微孔板发挥功能的作用。
[0024]第3专利技术的特征在于，在第1专利技术中，具备：细胞培养插件的第1内壁，其一端被多孔质膜闭塞，且作为细胞培养室的内壁使用；细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种细胞培养装置，其特征在于，具备细胞培养室，将形成为筒状的内壁被多孔质膜(3)上下划分而成的一对细胞培养室连接多个而使被上下划分的所述细胞培养室分别一体化，其中，所述多孔质膜(3)形成为两面可固着生物材料，并且具备细胞培养室盖，其将被划分且被分别一体化的所述细胞培养室中的至少任一方同时闭塞。2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，具有：细胞培养板(33)，其具有作为所述内壁使用的多个第1通孔(33d)，同时以覆盖该第1通孔(33d)的方式在底面(33b)设置有由所述多孔质膜(3)形成的片(34)，第1底面盖(35)，其上部开口，在底板(35a)设有与所述第1通孔(33d)一起作为所述内壁使用的多个第2通孔(35c)，并且，设于所述细胞培养板(33)的所述底面(33b)，以及第2底面盖(36)，其作为所述细胞培养室盖，设于所述第1底面盖(35)的所述底板(35a)；所述第2通孔(35c)设置在俯视设于所述细胞培养板(33)的所述底面(33b)的状态的所述第1底面盖(35)时与所述第1通孔(33d)匹配的位置。3.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，具备：细胞培养插件(32)的第1内壁(32b)，其一端被所述多孔质膜(3)闭塞，且作为所述细胞培养室的所述内壁使用，细胞培养板(29)，其内插有该细胞培养插件(32)，且设有作为所述细胞培养室的所述内壁使用的多个通孔(29e)，以及平板状的第1板盖(30)和第2板盖(31)，其作为所述细胞培养室盖，分别设于所述细胞培养板(29)的两面且覆盖内插有所述细胞培养插件(32)的状态的所述通孔(29e)。4.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，具备：作为所述细胞培养室使用的膜保持件(27)，其一端被所述多孔质膜(3)闭塞，且具备作为所述内壁使用的第2内壁(27b)，板(22)，其在形成有多个第1通孔(22b)的平板状的第1基部(22a)的一面垂直竖立有第1筒体(22c)，所述第1筒体(22c)与所述第1通孔(22b)连通、内部设有所述膜保持件(27)、且与所述第1通孔(22b)一起作为所述内壁使用，板盖(23)，其在平板状的第2基部(23a)的一面设有与多个所述第1筒体(22c)分别同时嵌合的多个第1突出部(23b)，作为所述细胞培养室盖而覆盖内部设有所述膜保持件(27)的状态的所述第1通孔(22b)，衬套盖(24)，其在平板状的第3基部(24a)的一面设有与多个所述第1筒体(22c)分别同时嵌合的多个第2突出部(24b)，作为所述细胞培养室盖而覆盖内部设有所述膜保持件(27)的状态的所述第1通孔(22b)，衬套(25)，其在形成有数量与所述第1通孔(22b)相同的、作为所述内壁使用的第2通孔(25b)的平板状的第4基部(25a)的一面以与所述第2通孔(25b)连通的方式垂直竖立有多个第2筒体(25c)，所述多个第2筒体(25c)与所述第1筒体(22c)一起构成所述细胞培养室、分别同时向多个所述第1筒体(22c)进行内插且与所述第2通孔(25b)一起作为所述内壁使用，以及
挤出件(26)，其在平板状的挤出板(26a)的一面垂直竖立有多个挤出部(26b)，所述多个挤出部(26b)分别同时向多个所述第1通孔(22b)进行内插。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：竹下幸男，藤川晋，松尾欣哉，藤泽美和子，玉田雅也，冈本雅史，盐田考矢，畑朋宏，福迫阳人，
申请(专利权)人：国立大学法人山口大学，
类型：发明
国别省市：