来自于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶的改良酶变体制造技术

本发明专利技术涉及具有乳糖酶活性的变体多肽。本发明专利技术还涉及编码此类变体多肽的核酸序列，包含所述核酸序列的核酸构建体，包含所述核酸构建体的重组表达载体和包含所述表达载体的重组宿主细胞。进一步地，本发明专利技术涉及经由使用此类宿主细胞生产乳糖酶变体的方法。而且，本发明专利技术涉及生产乳糖酶多肽变体的方法。本发明专利技术进一步涉及包含乳糖酶变体的组合物，在乳制品的制备中此类乳糖酶变体的用途或含乳糖酶变体的组合物的用途，生产乳制品的方法及所得乳制品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及具有乳糖酶活性的变体多肽。本专利技术还涉及编码此类变体多肽的核酸序列，包含所述核酸序列的核酸构建体，包含所述核酸构建体的重组表达载体和包含所述表达载体的重组宿主细胞。进一步地，本专利技术涉及经由使用此类宿主细胞生产乳糖酶变体的方法。而且，本专利技术涉及生产乳糖酶多肽变体的方法。本专利技术进一步涉及包含乳糖酶变体的组合物，在乳制品的制备中此类乳糖酶变体的用途或含乳糖酶变体的组合物的用途，生产乳制品的方法及所得乳制品。专利技术背景本专利技术涉及乳糖酶。乳糖酶或β-半乳糖苷酶(E.C：3.2.1.23)是一种催化乳糖(一种二糖)水解成其组分单糖葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖存在于乳制品中并且更具体地存在于乳、脱脂乳、乳酪、冰淇淋、发酵乳制品例如酸奶、许多未成熟干酪和其它乳制品中。在幼年哺乳动物(其中包括人)的肠壁内通过自然存在的乳糖酶发生乳糖的分解。仅一小部分成年群体尚未丧失这种性能并且仍然可以消化乳糖。在大多数成体中由乳糖引起的营养和功能问题是由乳糖酶的缺乏而引起并且众所周知且有描述。此类群体的成员不能使乳糖水解，在这种情况下乳糖进入大肠，在这里其导致脱水、钙吸收差、肠胃气胀、嗳气和痉挛，并且，在严重的情况下，甚至水性爆发性腹泻。乳糖酶重要的工业应用是在用于乳糖不耐受个体的乳糖水解乳制品的生产中。此类水解乳制品包括巴氏灭菌乳、UHT乳及用或不用中间加工步骤(例如蛋白水解)由其全部或部分原始组成部分复原的乳。用乳糖酶处理可在热处理乳之前或之后进行。可通过将酶添加到乳中或其含乳糖的组成部分之一中进行乳糖酶处理。乳糖的溶解特性使得可能导致其在以高浓度存在时结晶，在乳制品例如炼乳、淡奶、乳粉、冻乳、冰淇淋和在具有高乳含量的甜食产品中产生沙粒状或颗粒状质地。乳糖被乳糖酶全部或部分水解消除了这个问题，从而提供具有均匀质地的产品并且因此消费者接受程度更高。乳糖酶的另一种工业应用是增加含乳糖的产品如乳或酸奶中的甜味。此类产品中乳糖的水解由于生成葡萄糖而导致甜味增加，而产品的热量值不增加。相反，乳糖酶的使用还可减少变甜的乳制品中的糖添加，而不会损害甜味。乳糖酶的另一种工业应用是含有乳组分的乳糖产品例如面包的水解。在此类产品中添加乳糖以增强风味、保持水分、提供褐变和改善烘烤特性。水解的乳糖糖浆有望例如增强面包皮显色、改善风味和香气、改变质地、延长保存期限和加强面包结构。发酵乳制品例如酸奶中乳糖被乳糖酶水解将增加甜味。同样，在发酵过程开始之前添加乳糖酶时，可提高酸发展的速率并且因此减少加工时间。乳或乳源性产品例如乳清的乳糖酶处理使得此类产品适合应用于动物饲料和宠物食品中用于乳糖不耐受动物，例如猫。乳糖水解允许生产更高浓度的乳清并且同时预防与早先关于乳糖缺陷患者描述的问题类似的肠道问题。浓缩乳糖水解乳清以生产含有70-75％固体的糖浆并且用作冰淇淋、面包和甜食产品中的食品成分。乳糖酶已有描述并且从多种生物，包括微生物中分离。乳糖酶常常是微生物如克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)和杆菌属(Bacillus)的细胞内组分。克鲁维酵母菌属并且尤其是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，和其它酵母例如念珠菌属(Candida)、圆酵母属(Torula)和球拟酵母属(Torulopsis)的酵母是酵母乳糖酶的常见来源，而凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)或乳酸菌是众所周知的细菌乳糖酶来源。源自这些生物的几种商用乳糖酶制剂可用，例如(来自于乳酸克鲁维酵母，由荷兰代尔夫特DSM生产)。这些乳糖酶是所谓的中性乳糖酶，因为其具有介于pH＝6和pH＝8之间的最适pH。虽然酵母中性乳糖酶常常在工业上用于生产无乳糖或乳糖减少的乳制
品，但酶处理的使用成本往往很高。酶的使用成本相对较高的主要原因是：●为了维持生产工厂内的卫生状况，在低温下进行培育。在这个温度下工业上使用的乳糖酶不是很活跃并且应按相对高的剂量添加。●目前使用的乳糖酶在用乳糖酶培育后期，受其产物，尤其是半乳糖抑制。当需要具有低残留乳糖浓度的产品时，必须添加额外的酶以补偿由于半乳糖积累而引起的活性降低。●目前使用的乳糖酶在乳中具有相对较低的比活性，在应用中需要使用高酶剂量。因此，生产乳糖减少和无乳糖的产品的酶剂量和成本相对较高。显然需要一种或多种能够克服以上提到的至少一种缺点的乳糖酶变体。
技术实现思路
本专利技术涉及具有乳糖酶活性的变体多肽，即涉及乳糖酶变体。本专利技术的乳糖酶变体与参考多肽相比可具有一种或多种改良的特性，所述参考多肽通常具有乳糖酶活性。参考多肽可为野生型乳糖酶，例如来自于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶。本专利技术的变体多肽可称为“乳糖酶变体”、“改良乳糖酶”等等。已生成克鲁维酵母中性乳糖酶的变体，其具有导致在乳糖减少或无乳糖的乳制品生产中此类乳糖酶的使用成本降低的特性。具有关于乳制品生产的改良特性的乳糖酶变体可展示：●针对ONPG更高的比活性；●针对乳糖更高的比活性；●在低温乳中的针对乳糖更高的活性；●半乳糖抑制降低；和/或●在乳中更高的GOS产量。与参考多肽相比，可测定这些改良中的每一种。而且，与参考多肽相比，本专利技术的变体多肽可具有至少2种或3种或4种改良特性。表1提供了改良特性组合的实例。因此本专利技术提供了具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下
述氨基酸序列，在与包含SEQ ID NO:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于第233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID NO:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性并且其中所述变体与SEQ IDNO:2具有至少60％序列同一性。本专利技术还提供了：-编码本专利技术的变体的核酸序列；-包含此类核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列与能够指导乳糖酶在合适表达宿主中的表达的一个或多个控制序列可操作性连接；-包含此类核酸构建体的重组表达载体；和-包含此类表达载体的重组宿主细胞。本专利技术还涉及生产乳糖酶的方法，其包括在有助于乳糖酶生成的条件下培养本专利技术的宿主细胞并且回收乳糖酶。此外，本专利技术涉及生产乳糖酶多肽变体的方法，所述方法包括：a)选择具有乳糖酶活性的多肽；b)取代对应于233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨基酸中的任一个的至少一个氨基酸残基，所述位置参照SEQ ID NO:2定义；c)任选地取代如b)中所限定的一个或多个另外的氨基酸；d)制备由步骤a)-c)产生的变体；e)测定变体的特性；及f)选择与包含SEQ ID NO:2中列出的序列的乳糖酶相比具有改变特性的变体并选择与SEQ ID NO:2具有至少60％序列同一性的变体，从而产生乳糖酶多肽变体。进一步地，本专利技术涉及：-组合物，其包含本专利技术的变体或通过本专利技术的方法能够获得的变体；-在乳制品的制备中根据本专利技术的变体乳糖酶或本专利技术的组合物的用途；-生产乳制品的方法，所述方法包括向乳中添加有效量的根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基酸序列，在与包含SEQ ID NO:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于第233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID NO:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性并且其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.14 EP 14151124.6;2014.05.26 EP 14169816.71.一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基酸序列，在与包含SEQ ID NO:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于第233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID NO:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性并且其中所述变体与SEQ IDNO:2具有至少80％序列同一性。2.根据权利要求1所述的变体多肽，其中所述参考多肽为SEQ ID NO:2的乳糖酶。3.根据权利要求1或2所述的变体多肽，其中所述变体多肽为非自然存在的多肽。4.根据权利要求1-3中任一项所述的变体多肽，其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比针对ONPG展示出增加的比活性。5.根据权利要求4所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQID NO:2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含对应于第415、483、619、621、622或633位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代。6.根据权利要求4或5所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO:2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自T415C、T415A、A483S、V619I、I621V、M622L或T633G的至少一个取代。7.根据权利要求1-3中任一项所述的变体多肽，其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比针对乳糖展示出增加的比活性。8.根据权利要求7所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQID NO:2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含对应于第415、440或483位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代。9.根据权利要求7或8所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO:2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自T415C、
\tT415A、Y440F或A483S的至少一个取代。10.根据权利要求1-3中任一项所述的变体多肽，其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比针对乳中的乳糖展示出增加的比活性。11.根据权利要求10所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO:2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含对应于第233、257、258、263、274、284、297、440、619、633、862或1004位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代。12.根据权利要求10或11所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO:2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自D233V、D257G、A258T、N263S、K274E、N284S、E297G、Y440F、V619I、T633G、L862V或A1004P的至少一个取代。13.根据权利要求10或11或12所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO:2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自N263S、K274E或N284S的至少两个取代。...

【专利技术属性】
技术研发人员：芮妮马赛尔钟德，乌尔丽克玛利亚穆勒，彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞斯·蒂克尔，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL