本发明专利技术公开了一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，该方法包括以下步骤：将磁珠和含有抗体的表达产物加入到反应容器中，在反应容器外部或内部施加磁场，然后转移出上清液；将洗涤缓冲液加入反应容器中，撤去磁场；重复洗涤磁珠2~4次；然后加入洗脱缓冲液，撤去磁场，室温下孵育5~15min；施加磁场使磁珠贴壁，转移出溶液，调节溶液的pH值至中性，得到纯化后的抗体。本发明专利技术使用磁珠亲和分离技术进行抗体纯化，比传统的抗体亲和层析技术具有更快的抗体捕获速度；此外，纯化操作无需复杂的层析系统，样品无需进行澄清处理，可以直接对粘度较大的样品进行纯化操作；再者，使用了独特的蛋白A包被磁珠，抗体结合效率大幅提高，蛋白A配基的脱落率达到极低水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗体纯化的方法，具体涉及一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法。
技术介绍
单克隆抗体是B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的，其重链和轻链所形成的结构域可以识别和结合特异抗原。1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌的嵌合单克隆抗体药物Rituxan Anti-⑶20抗体上市，至2007年，FDA已批准了 20多种治疗性单克隆抗体药物，约一半用于治疗癌症，多个已成为年销售额超十亿美元的“炸弹药物”。全球单克隆抗体药物的市场增长十分迅猛，约有200多种单抗处于临床实验阶段，占整个临床生物技术药品总数的三分之一多，其中四分之一在临床三期或等候批准。单抗药物已成为全球生物制药领域发展的主旋律。·单抗药物的迅猛发展对抗体纯化工业提出了新的挑战。目前，主流的抗体纯化生产主要包括以下步骤1、发酵液澄清；2、抗体捕获；3、抗体精细纯化；4、抗体浓缩洗滤；5、抗体过滤除菌/制剂。在抗体捕获阶段，主要应用蛋白A亲和层析技术从发酵上清液中提取抗体。蛋白A是一种从金黄葡萄球菌细胞膜上提取的蛋白，具有5个IgG结合结构域，能特异性地与抗体Fe端结合。现阶段最常用的蛋白A亲和层析介质是通过将蛋白A用化学偶联的方法固定在琼脂糖凝胶表面制成亲和填料，然后装填成层析柱。将含有抗体的发酵上清液用泵加压注入层析柱中，抗体被层析填料上固定的蛋白A捕获，被捕获的抗体可以通过洗脱溶液的冲洗从蛋白A亲和填料上解离，达到纯化及浓缩的目的。然而，以上抗体纯化过程存在以下缺点I、发酵溶液需进行澄清操作。单抗通常采用哺乳动物细胞无血清悬浮培养的方法进行制备，发酵液中存在大量细胞，容易对层析系统造成堵塞。因此在层析操作之前需经过离心或过滤操作，去除发酵液中的细胞。工业上大规模的澄清操作通常需要流式离心机或是超滤系统，耗时长、价格高昂而且日常维护复杂。2、层析操作耗时长，仪器昂贵。由于填料可承受的压力及流速有限，因此单位时间内可处理的样品量受限于层析柱的大小及填料性质。大型的层析设备及蛋白A亲和纯化填料非常昂贵，且基本依赖进口，是抗体纯化工业的瓶颈。3、层析系统不能处理高粘度样品。由于受限于填料可承受的压力，因此高粘度的样品(如血清或高蛋白浓度样品)均需要经过稀释及过滤才能应用于层析操作，造成样品体积的放大及目标产物的稀释。4、蛋白A亲和层析填料在反复冲洗的过程中容易发生蛋白A配体的脱落。蛋白A在琼脂糖基质上是通过共价偶联实现固定。比较先进的填料为实现蛋白A配基朝向的一致性而达到提高配基利用率的目的，均采用单点定向固定法，即蛋白A与琼脂糖之间只通过一个共价键进行连接，但这种单点固定的方法使蛋白A容易在反复的层析柱冲洗过程中发生脱落。而蛋白A是高致敏原，容易在人体内引起免疫反应，美国食品及药品监督管理局(FDA)对单抗药物中蛋白A配基的残留量有严格的限定。蛋白A脱落现象也影响了亲和填料的有效载量及使用寿命。近年来，随着磁性分离技术的发展，蛋白A包被的超顺磁性磁珠越来越多地应用于免疫检测及小规模的免疫亲和纯化领域。蛋白A包被磁珠纯化技术无需复杂的层析设备，对样品的澄清度没有限制，只需要简单的磁性吸附步骤即可很方便快捷地从单抗表达产物中分离单抗，有效解决了传统层析技术的不足之处。但由于目前市面上出现的蛋白A包被磁珠的抗体结合效率相对于传统的琼脂糖填料仍有很大的差距，因此仍未能大规模地应用于抗体纯化工业。
技术实现思路
为了克服上述的现有抗体纯化方法的缺点，本专利技术的目的在于提供一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现 一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，包括以下步骤(I)将蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗体的表达产物加入到反应容器中，搅匀，室温下孵育5 15min，磁珠在溶液中呈均匀分布状态；在该过程中磁珠与抗体结合；(2)在反应容器外部或内部施加磁场，使磁珠沿磁场方向运动并贴在容器壁上(见图I)或磁体上(见图2)；(3)从反应容器中转移出上清液；在该过程中，抗体随磁珠贴在容器壁上或磁体上，其余成分被转移出反应容器；(4)将洗涤缓冲液加入反应容器中，撤去磁场，使磁珠重新均匀分散于洗涤缓冲液中；重复步骤(2) (3)，完成一次磁珠洗涤；(5)重复步骤(4)洗涤磁珠2 4次，彻底洗去磁珠上的非特异吸附物质；(6)将洗脱缓冲液加入反应容器中，撤去磁场，使磁珠重新均匀分散于洗涤缓冲液中，室温下孵育5 15min ;该操作是将磁珠上的抗体洗脱下来；(7)施加磁场使磁珠贴壁，转移反应容器中的溶液，调节溶液的pH值至中性，得到纯化后的抗体。步骤(I)中的蛋白A的高密度包被磁珠已经申请专利，即是中国专利申请201210107107. 7 (申请号)实施例I得到的交联有固定化SL-PA融合蛋白的磁珠。步骤(I)所述的含有抗体的表达产物可以是血清、细胞表达液或腹水。步骤(2)和(7)所述的施加磁场，其磁通量为100(Γ10000高斯，作用时间为l-5min。步骤(4)所述的洗涤缓冲液含有O. 0Γ0. 5Μ的磷酸缓冲液、I 500mM的NaCl，余量为水，pH值6 9。步骤(6)所述的洗脱缓冲液含有O. 0Γ4Μ的氨基酸，pH值I. 9飞；所述的氨基酸为甘氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种以上。步骤(7)所述的调节pH值是用IM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液调节。使用后的磁珠重复步骤(4)，洗涤至pH值为中性后可重复用于抗体纯化。本专利技术的机理是磁性材料的磁性随温度的变化而变化，在低温时材料的磁性很难被改变；而当温度升高时，材料将变成“顺磁体”，其磁性很容易随周围的磁场改变而改变。如果温度进一步提高，或者磁性颗粒的粒度很小时，即便在常温下，磁体的极性也呈现出随意性，难以保持稳定的磁性能，这种现象就是超顺磁效应。超顺磁性磁珠能在外部磁场的作用下迅速聚集，当磁场撤离后即可重新分散而不带有剩磁。本专利技术即利用磁珠的这一特性使其作为一种新型的分离纯化基质用于生物活性物质的分离纯化技术上。 本专利技术基于利用SLP将功能蛋白定向固定的方法，获得具有固定化蛋白A配基的超顺磁性磁珠(见专利201210107107. 7实施例I)。利用该磁珠对抗体的高效特异性结合，从血清或抗体表达产物中捕获抗体，然后利用磁性分离器将磁珠-抗体复合物从混合液中分离，经过对磁珠复合物的多次洗涤，去除磁珠表面的非特异吸附物质，最后用洗脱缓冲液使抗体与磁珠解离并释放到洗脱缓冲液中，达到纯化抗体的目的。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果I、本专利技术使用磁珠亲和分离技术进行抗体纯化，比传统的抗体亲和层析技术具有更快的抗体捕获速度(〈15分钟)；此外，纯化操作无需复杂的层析系统，样品无需进行澄清处理，可以直接对粘度较大的样品进行纯化操作。2、与现有的磁珠亲和分离技术相比，本专利技术由于使用了独特的SLP固定化技术制备的蛋白A包被磁珠，抗体结合效率大幅提高，蛋白A配基的脱落率达到极低水平，使磁珠分离技术在单克隆抗体大批量纯化中的应用成为可能。3、本专利技术的纯化方法节省了发酵液澄清步骤。本专利技术采用磁珠与样品直接混合孵育的方式从样品中捕获抗体，对样品的澄清度及粘度没有特殊要求，可以省去传统抗体层析纯化工艺中样品澄清过滤的步骤，节省了相应的生产时间及设备需求。4、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗体的表达产物加入到反应容器中，搅匀，室温下孵育5~15min；（2）在反应容器外部或内部施加磁场；（3）从反应容器中转移出上清液；（4）将洗涤缓冲液加入反应容器中，撤去磁场；重复步骤（2）~（3）一次；（5）重复步骤（4）洗涤磁珠2~4次；（6）将洗脱缓冲液加入反应容器中，撤去磁场，室温下孵育5~15min；（7）施加磁场使磁珠贴壁，转移反应容器中的溶液，调节溶液的pH值至中性，得到纯化后的抗体；步骤（4）所述的洗涤缓冲液含有0.01~0.5M的磷酸缓冲液、1~500mM的NaCl，余量为水，pH值6~9；步骤（6）所述的洗脱缓冲液含有0.01~4M的氨基酸，pH值1.9~5。
【技术特征摘要】
1.ー种利用蛋白A的高密度包被磁珠纯化抗体的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗体的表达产物加入到反应容器中，搅匀，室温下孵育5 15min ； (2)在反应容器外部或内部施加磁场； (3)从反应容器中转移出上清液； (4)将洗涤缓冲液加入反应容器中，撤去磁场；重复步骤(2) (3)一次； (5)重复步骤(4)洗涤磁珠2 4次； (6)将洗脱缓冲液加入反应容器中，撤去磁场，室温下孵育5 15min； (7)施加磁场使磁珠贴壁，转移反应容器中的溶液，调节溶液的pH值至中性，得到纯化后的抗体； 步骤(4)所述的洗涤缓冲液含有O. ΟΓΟ. 5Μ的...
【专利技术属性】
技术研发人员：任辉，张曙光，韩蓝青，乌韦·斯莱泰，安德烈亚斯·布韦特莱瑟，刘蔼珊，
申请(专利权)人：海狸纳米科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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