生产伽马-羧化的蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及生产大量的伽马-羧化的蛋白的方法和工具，包括：(i)培养细胞，所述细胞被改造来以至少10∶1的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码Y-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列。本专利技术进一步涉及以高产量生产需要Y-羧化作用的蛋白的方法。
技术介绍
出血是常见的临床问题。它是疾病、外伤、手术和药物治疗的结果。机械性地阻止出血是必要的。由于出血的位置或由于从许多(小)脉管散开，这是非常困难的或甚至是不可能的。因而出血的病人可能需要用支持止血的试剂治疗。这可以是血液衍生产品(血治疗，heamotherapy)、引起内源止血剂的释放的试剂、重组凝结因子(F)或延迟血液凝块分解的试剂。通常从地方医院获得的血液衍生产品之中第一线的治疗(first line treatment)是用于容量置换和支持止血的全血，包装的红细胞用于改善氧转运容量，血小板浓缩物以提高血小板数量(如果数量低或有缺陷)和新鲜的冷冻血浆用于支持止血(血液凝结和血小板聚集)。支持止血的第二线的血浆衍生产品是血浆冷沉淀物、凝血酶原复合物浓缩物、活化的凝血酶原复合物浓缩物和纯化的凝结因子。作为人类重组蛋白，无活性的 (凝结因子VIII和IX)和活化的(凝结因子Vila)，一些凝结因子当今是可获得的。血友病是遗传的或后天的出血失调，有异常的或缺陷的凝结因子或抑制促凝血功能的针对凝结因子的抗体。最常见的血友病是血友病A(缺乏凝结因子VIII)和血友病 B(因子IX)。提纯的或重组的单独的凝结因子是血友病病人的主要治疗手段。有抑制性抗体的病人遇到了治疗难题，因为抗体也可以中和向该病人施用的凝结因子。通过降解活化的凝结因子Va和Villa，蛋白C的活性形式(APC)是血浆凝结的抑制物。已经显示重组的APC是败血症病人中不适当的血浆凝结的有效治疗手段。尽管纯化过程并不简单和需要许多步骤，某些步骤目的在于消除污染的病毒，用于治疗用途的凝结因子可以从人类血浆获得。但是尽管有血液衍生产品的大量的安全性测量和测试，也无法排除感染性病毒或朊病毒的污染。由于这种风险，非常期望从无动物衍生成分的培养基中生长的重组细胞中产生人类治疗性蛋白。这不总是简单的，因为许多蛋白需要哺乳动物宿主来以完全功能性的形式产生，即，被正确地翻译后修饰。在重组细胞中商业化生产的凝结因子有FVII (NovoSeven)、FVIII (Kogenate，Recombinate, Refacto)和 FIX (BeneFix)(Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11 :169-177，1997)和 Active Protein C(Xigris)。在获取大量的全功能重组人凝结因子时的一个主要障碍在于FII、FVII, FIX、FX和蛋白C中存在的Gla结构域。这个结构域含有通过添加羧基基团翻译后修饰的谷氨酸残基。这些因子的生产受到如下事实的妨碍，即它们的过量表达引起羧化不足，由此产生无活性的蛋白。Gla修饰是被称为Y-谷氨酰羧化酶(GGCX)的维生素K依赖性酶的作用的结果。许多科学家，特别是那些致力于凝结因子研究的科学家已经对这个酶进行了广泛的研究(W0-A-8803^6 ;Wu et al. Science 254 (5038) 1634-1636，1991 ； Rehemtulla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 90 :4611-4615,1993 ；Stanley J. Biol. Chem. 274(24) : 16940-16944，1999 ；Vo et al.，FEBSletters 445 :256-260,1999 ；Begley et al. ,The Journal of Biological Chemistry 275(46) :36245-36249,2000 ；Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276 (11) :7769-7774,2001 ；Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3) : 1264—1269，2002 ；Czerwiec et al. ,EurJ Biochem 269 :6162-6172,2002 ；Hallgren et al. , Biochemistry 41 (50) :15045-15055,2002 ； Harvey et al. , The Journal of Biological Chemistry 278(10) :8363-8369,2003)。至少两个科学团队已经进行了通过与凝结因子FIX共表达GGCX来提高产量的尝试，但是没有成功(Rehemtulla, et al. 1993, ibid ；Hallgren et al. 2002，ibid)。考虑到在 Y _ 羧化蛋白方面的巨大兴趣，可以推测有更多的共表达试验失败了并因此没有被报道。对于人类FII (凝血酶原)，为了获得全功能的凝血酶原，10个Glu残基中的至少 8 个必需被正确地修饰(Malhotra，et al.，J. Biol. Chem. 260 :279-287,1985 ；Seegers and Walz' Prothrombin and other vitamin K proteins' , CRC Press, 1986)。获得 rhFII的高生产水平的广泛的努力已经利用了几种不同的系统，例如，CHO细胞、BHK细胞、 293细胞和牛痘病毒表达系统，但是都失败了或产生了羧化不足的产物，因而是功能上无活性的凝血酶原 ΦΕΘηβΘη et al.，J.Biol· Chem. 262 :6729-6734,1987 ；Russo et al.， Biotechnol Appl Biochem 14(2) :222-233,1991 ；Fischer et al.,J Biotechnol 38(2) 129-136,1995 ；Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3) :358-364,1996 ；Russo et al.,Protein Expr. Purif. 10 :214-225,1997 ；Vo et al. 1999,ibid；Wu and Suttie Thromb Res 96(2) :91-98,1999)。较早报道的羧化的重组人类凝血酶原的生产能力很低；突变凝血酶原 20mg/L (Cote et al.，J. Biol. Chem 269 :11374-11380,1994)，在 CHO 细胞中表达的人类凝血酶原0. 55mg/L(完全羧化的，J(trgensen et al. 1987，同上)，在CHO细胞中的 25mg/L(羧化的程度未显示，Russo et al. 1997，同上)。WO 92/19636公开了人类和牛的维生素K依赖性羧化酶的克隆和序列鉴定。该申请建议在适合的宿主细胞中共表达维生素K依赖性羧化酶和维生素K依赖性蛋白来制备维生素K依赖性蛋白。没有例举本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·芬格，A·勒夫格伦，A·特林，
申请(专利权)人：阿斯特拉曾尼卡有限公司，
类型：发明
国别省市：