本发明专利技术提供了BnaA.BCCP2.a基因及其在提高植物及藻类油脂含量方面的应用。该基因来源于植物甘蓝型油菜(Brassica?napus)。该基因编码异质型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的生物素羧基载体蛋白亚基(BCCP)。该发明专利技术涉及BnaA.BCCP2.a基因转化植物与藻类能提高其油脂含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及&iaA. BCCP2. a基因，包含其的表达载体及高等植物和藻类，及其提高植物种子和藻类的油脂含量的应用。
技术介绍
油菜是我国重要的油料作物，在过去的30年里，油菜仅次于大豆和油棕，已经成为世界上第三大油料作物。我国是油菜种植面积最大的国家，种植区域极为广泛，遍及全国各地，总产量居世界第一。油菜的油脂合成是一个非常复杂的多因素多基因控制的数量性状。前人通过采用常规育种的方法，已经得到含油量具有较大差异的油菜品种。但是随着生物技术的迅猛发展，利用基因工程进一步提高油菜油脂含量是改良油菜的又一重要手段。微藻能源作为生物能源领域的战略储备，目前已引起国内外高度重视。它具有产能大、无污染、可再生、易培养、含有较多的脂类物质等优点。同时把它转化为生物燃料的效率较高，也具有较大的食用和化学利用价值。由于以上多方面的优势，微藻被认为是当今最有开发前途的能源之一1。小球藻是一种单细胞真核藻类，具有繁殖速度快、无性生殖、易培养、可以进行光自养培养、也可以进行无光照的异养培养、可规模化生产等特点，所以，小球藻是进行能源微藻研究的一个潜在的理想材料2。基因工程技术已被广泛应用于作物改良，并取得了许多显著的成效。而通过基因工程技术提高真核藻类总的油脂含量的研究报道很少3。根据在植物中的研究经验，通过基因工程技术来提高藻类的油脂含量的研究是一个不可回避的课题。生物体中ACCase有2种类型。一种是异质型(heteromeric)，其包含4个亚基， 即生物素羧化酶(biotin carboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein, BCCP)以及羧基转移酶(carboxyltransferase，CT)的 2 个亚基 α -CT 和β-CT4-7。另一类ACCase称为同质型(homomeric)，与异质型ACCase不同的是同质型ACCase的各功能域融合成一条多肽链，具有一个分子量为220_260kD的生物素包含亚基8，存在于酵母9-10、藻类11、动物12-13以及植物14-17的胞质溶胶中。这类单亚基ACCase含有3个功能域，在序列上对应于异质型ACCase的BC、BCCP、α -CT和β -CT。 两种不同类型的ACCase在脂肪酸的合成中有不同的作用，异质型ACCase催化产生的丙二酰辅酶A用于脂肪酸的从头生物合成，而同质型ACCase催化产生的丙二酰辅酶A则用于脂肪酸链的延伸及类黄酮许多次生代谢产物的合成18-19。已经证明，异质性ACCase是脂肪酸生物合成的关键酶或限速酶，是碳流进入脂肪酸生物合成的重要调控位点20-23。由于ACCase是脂肪酸生物合成的限速酶，人们期望能通过超量表达ACCase基因提高油料作物的种子含油量。GengerAach等发现在早期种子发育过程中ACCase基因表达量的增加与种子成熟时含油总量增加具有相关性24。kllwood等通过反义表达技术抑制油菜同质型ACCase的活性，获得的转基因植株成熟种子的含油量显著低于对照25。Ohlrogge等将油菜种子贮藏蛋白napin特异性表达启动子连接到拟南芥同质型ACCase基因上，将其转入油菜中，获得的转基因植株T1代成熟种子的脂肪酸含量增加了 5 %，T2代脂肪酸含量增加了 5-6. 5%26。由于异质型ACCase由4个亚基组成，同时转化植物或小球藻比较困难。 BCCP亚基是生物素羧基载体蛋白，负责在生物素羧化酶与羧基转移酶之间转运分子， 在异质型ACCase行使功能的过程中起到桥梁的作用。目前尚未检索到来自油料作物甘蓝型油菜的编码BCCP2亚基的基因转化植物或小球藻并提高其油脂含量的研究27。本专利技术发现来源于甘蓝型油菜编码BCCP2亚基的BnaA. BCCP2. a基因转入植物和藻类后，可以使植物种子和藻类的油脂含量显著提高。
技术实现思路
本专利技术的一方面提供了异质型乙酰辅酶A羧化酶的生物素羧基载体蛋白亚基 BCCP，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本专利技术的另一方面提供了编码所述异质型乙酰辅酶A羧化酶的生物素羧基载体蛋白亚基BCCP的基因。优选地，其为来源于甘蓝型油菜的DNA片段的BnaA. BCCP2. a，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本专利技术的另一个方面提供了含本专利技术所述基因(优选BnaA. BCCP2. a)的植物表达载体。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如？81附9、？81121、？81221，？0&1111^3 1300，pGreen等的植物表达载体。本专利技术的载体也可含有适当的启动子。在本专利技术中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin、ACtin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。本专利技术的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化， 微注射，电穿孔等方式导入植物细胞和藻类细胞。本专利技术在一个方面提供了包含本专利技术所述基因的植物或藻类，其选自藻类，拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻和花生等。优选地，所述藻类选自小球藻。更具体地，所述小球藻选自椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)。本专利技术还提供了提高植物种子或藻类中总脂肪酸含量的方法，其特征在于将本专利技术所述基因(优选BnaA.BCCP2.a)转化到所述植物或藻类中。其中所述藻类和植物如上所述。本专利技术还提供了提高植物种子或藻类中油酸或亚油酸含量的方法，其特征在于将本专利技术所述基因(优选BnaA.BCCP2.a)转化到植物或藻类中。其中所述藻类和植物如上所述。可使用本专利技术的方法转化的真核生物选自由藻类和植物等真核生物组成的组。其中所述藻类和植物如上所述。本专利技术还涉及本专利技术所述基因(优选BnaA. BCCP2. a)在提高植物或藻类中总脂肪酸或油脂含量中的应用。其中所述藻类和植物如上所述。附图说明图1植物表达载体pBI121_BnaA. BCCP2. a的构建图2含nos终止子的载体图构建过程图3空载(UN-CK)小球藻表达载体图构建图4小球藻表达载体&iaA. BCCP2. a的构建图5转基因藻株的PCR检测。M =Marker, 1-6 阳性藻株，CK 对照藻株。图6转基因藻株的RT-PCR检测。M =Marker, 1-4 阳性藻株，CK 对照藻株。图7转基因藻株的Southern检测。1_4 阳性藻株，5 对照藻株。图ST2代转基因株系与野生型拟南芥脂肪酸GC-MS测定结果比较，(a) CK 对照， (b)转基因株系1^2-6。实施例1、油菜toaA. BCCP2. a基因的克隆与序列结构分析以大田种植的甘蓝型油菜8953(Brassica napus，来自于南京农业大学)为材料，取其授粉后30d的幼嫩种子(约IOOmg)，置于液氮中研磨至材料完全破碎，按照 Bio-Med(北京)试剂盒操提取RNA，以带polyT的引物进行逆转录获得cDNA，并进行 RT-PCR (具体操作参见 Kit DRRO19A, Takara Biotech. (D本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．异质型乙酰辅酶Ａ羧化酶的生物素羧基载体蛋白亚基ＢＣＣＰ，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，李之国，张建辉，尹维波，陈宇红，宋丽英，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11
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