一种羧基端蛋白水解酶及其基因制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，提取类芽孢杆菌基因组DNA，利用基因克隆技术，提供了一种羧基端蛋白水解酶基因，其核苷酸序列包括SEQ?ID?No.2所示的序列；其编码的蛋白是一种羧基端蛋白水解酶，具有从羧基端水解多肽链的活性，同时具有酪蛋白水解酶的活性，其氨基酸序列包括SEQ?ID?No.1所示的序列。本发明专利技术填补了我国在该领域研究的空白，为我国酶制剂的发展及其在化工工业、以及医药和基因工程领域的应用提供了新基因资源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种羧基端蛋白水解酶及其基因序列。
技术介绍
羧基端蛋白水解酶(carboxyl-terminal proteases, Ctps)是一类新型的丝氨酸蛋白水解酶，在构成蛋白质的多肽链的羧基端Ala-Ala、Ala_Leu、Ala_Lys、Ala-Ser>Ala-Val, Ala_Cys、Ala-Phe或Val-Ser等处水解氨基酸残基之间的肽键，对常规的蛋白酶抑制剂具有抗性。迄今为止,对光合细菌蓝藻(Synechocystis sp. 6803)中的羧基端蛋白水解酶(CtpA)的研究较为详细。蛋白质分子量为34kDa的CtpA存在于蓝藻类囊体中，催化光合系统II中重要蛋白Dl前体的水解，从其羧基端切除16个氨基酸残基而形成活性的Dl蛋白，以维持光合系统II反应中心构象的稳定，以及最初的光能吸收、传递和光化学反应。对鼻疽假单胞菌(Burkholderiamallei)中ctpA基因的缺失突变体的研究发现,该酶与细胞被膜完整性的维持相关。大肠杆菌(E. coli)中最初鉴定为末端特异性蛋白水解酶Tsp(tail-specific protease)具有与Ctps相似的保守核心序列。研究发现76kDa的Tsp是细胞内因环境应激(environmental stress)而产生的带有羧基端水解标签的异常蛋白的通用降解酶。此外，至今已从布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、伯氏疏螺旋体菌(Borreliaburgdorferi)> 绿藻(green alga)、集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)、高等植物，以及动物胰脏中克隆到ctps基因。Ctps含有由80-100个氨基酸残基组成的称为roz(Post-synaptic density protein-95>Discs large、Zonula occludens I)的保守结构域，在蛋白定位、信号转导和蛋白质复合体的组装等方面发挥着重要作用。Ctps可应用于传统的蛋白质多肽链的水解、蛋白质或多肽的修饰，以及疾病的诊断和治疗。目前越来越多的应用于基因工程领域，例如，重组人胰岛素的生产、肿瘤抗体导向酶-前体药物治疗(antibody-directed enzyme prodrugtherapy, ADEPT),以及急性膜腺炎诊断的血清标记等。蛋白水解酶占据全球酶制剂市场的60%，其中微生物是商品化蛋白水解酶的主要来源。然而，至今从微生物中克隆获得的Ctps仍然较少，难以满足化工、以及医药和基因工程等领域快速发展的需求；此外，国外对微生物中新型Ctps的研究有23篇研究论文报道(NCBI PUBMID数据库检索)，国内至今未见研究报道(中国知网数据库检索)。本专利技术运用基因克隆技术，成功克隆到一种羧基端蛋白水解酶基因，命名为ctpP，并获得了其全长基因序列。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种羧基端蛋白水解酶及编码该羧基端蛋白水解酶的基因。一种羧基端蛋白水解酶，其氨基酸序列包括SEQ ID No. I所示的序列，更优选的，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，含447个氨基酸。一种羧基端蛋白水解酶基因，是编码SEQ ID No. I所示羧基端蛋白水解酶蛋白的核苷酸序列，优选的，其核苷酸序列包括SEQ ID No. 2所示的序列，更优选的，其核苷酸序列是SEQ ID No. 2所示的序列，长度为1344bp，编码SEQID No. I所示羧基端蛋白水解酶蛋白的447个氨基酸(不包括I个终止密码子)。本专利技术还提供了含有上述羧基端蛋白水解酶基因的重组载体及宿主细胞。本专利技术提取类芽孢杆菌Paenibacillus sp.基因组DNA，利用基因克隆技术，从中成功克隆到具有酪蛋白水解活性和羧基端蛋白水解酶活性的ctp基因，命名为ctpP，并获得了其全长基因序列。该基因编码的蛋白是一种羧基端蛋白酶(命名为ctpP)，由447个氨基酸构成，具有酪蛋白水解酶活性和羧基端蛋白水解酶活性。与NCBI GenBank数据库中已知功能的微生物Ctps氨基酸序列的相似性为34-80%，该酶含有PDZ保守结构域，属于新型羧基端蛋白 水解酶。本专利技术填补了我国在该领域研究的空白，为我国酶制剂的发展及其在化工工业、以及医药和基因工程领域的应用提供了新基因资源。附图说明图I 为实施例中 E. coli BL21 (pET_28a_ctpP)在选择性 Skim Milk Agar(SMA) -Kanamycin (Kan) (30 μ g/ml)琼脂平板上的表型。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进一步详细、完整地说明。本专利技术所用主要试剂Trypton、YeastExtract、NaCl> Skim Milk、琼脂糖(Agrose)、50XTris-acetate-EDTA(TAE)buffer、BicinChoninic Acid(BCA)Protein AssayKit (上海生工生物工程技术服务有限公司)；酪蛋白(Casein)(上海宝曼生物科技有限公司)；ADNA/HindIII DNA marker、X_gal、IPTG(天根生物工程北京有限公司)；限制性内切酶 EcoRI 和 XhoI (Promega,美国)；T4 DNA Ligase、Premix Ex Taq Version 2. 0> TakaraMiniBEST GenomePurification Kit Ver. 2· O (TaKaRa大连宝生物工程有限公司)；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒。寡核苷酸引物、寡肽合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)。本专利技术所用菌株、载体和培养基E. coli BL21(天根生物工程北京有限公司)；pET-28a(Novagen,美国)；LB 培养基(含 l%Trypton、0. 5%Yeast Extract,O. 5%NaCl, pH7.2)，SMA 选择性培养基(含 2%Skim Milk,3. 5%Trypton、0. 2%Yeast Extract,0. 5%NaCl，pH7.2)，固体培养基含I. 5%agar。本专利技术所用主要仪器设备Mili-Q超纯水仪(Millipore Billerica,美国)，酶标仪 BioTek Synergy 2 (BioTek Instruments,美国)，超声波细胞粉碎仪(YJ92-IIN,宁波新芝生物科技股份有限公司)，SMA4000UV-Spectrophotometer (Merinton技术有限公司，北京)，核酸电泳仪(JY-SPBT,北京)、凝胶成像系统(Bio-RAD Molecular Imager GELDoctmXR+) (Bio-RAD,美国)，PCR 仪(Mastercycler, Eppendorf,德国)。离心机(5810R,Eppendorf 德国)。实施例I采用无菌水系列梯度稀释法，将含有类芽孢杆菌的菌悬液涂布于SM选择性培养基，涂布100 μ I/琼脂平板(90_直径)，涂布后的平板倒置于37°C培养箱24h。挑取SMA选择性培养基上有较大透明圈的菌落，于SMA选择性培养基纯化两次后，加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羧基端蛋白水解酶，其特征在于，其氨基酸序列包括SEQ？ID？No.1所示的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈兰明，李云霞，李柏林，潘迎捷，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：