磷脂酰肌醇聚糖3抗体及其偶联物制造技术

本发明专利技术提供了特异性结合GPC3的鼠的，嵌合的和人源化抗体及其偶联物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】磷脂酰肌醇聚糖3抗体及其偶联物相关申请的交叉引用本申请要求2018年2月15日提交的第62/631,353号美国临时申请的优先权权益，其内容通过引用全文纳入本文。
技术介绍
磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)是细胞表面蛋白聚糖，已知其在肝细胞癌细胞上表达，并已经在许多恶性细胞中被报道。本专利技术提供了GPC3抗体及其偶联物。专利技术概述本文提供了抗GPC3抗体和针对GPC3的抗体药物偶联物。特别是，本文提供了针对GPC3的微管蛋白裂解素(Tubulysin)抗体-药物偶联物，以及使用该偶联物治疗表达GPC3的疾病的方法。优选的抗GPC3抗体是鼠GPC3-1抗体的嵌合或人源化形式。鼠GPC3-1抗体包含具有SEQIDNO:8列出的氨基酸序列的重链可变区和SEQIDNO:9中列出的氨基酸序列的轻链可变区。附图说明图1显示了人GPC3的序列。图2A显示了hGPC3-1重链变体与人vH供体序列HV1-18/HJ4的序列比对。图2B显示了hGPC3-1重链变体与人vH供体序列HV1-69-2/HJ4的序列比对。图3显示了hGPC3-1重链变体的序列比对。图4显示了hGPC3-1轻链变体与人vL供体序列KV1-30/KJ2的序列比对。图5显示了hGPC3-1轻链变体的序列比对。图6显示了hGPC3-1ec的表面等离子体共振结合数据。(左)多个传感图数据代表与固定化hGPC3结合的不同浓度(400,160,64,25.6,10.2,4.1,和1.64nM)的hGPC3-1ec。(右)KD通过每种浓度下的600秒最大响应作图确定，并通过半最大结合定义。图7显示了体外细胞毒性实验的结果，其测试人源化GPC3-1ecSGD-6859或GPC3-1SGD-6183抗体-药物偶联物对一组表达GPC3的HCC细胞系的效果，这些细胞系包括JHH7,Huh7,和Hep3B。图8显示了体外细胞毒性实验的结果，其测试人源化GPC3-1ecSGD-6859或GPC3-1SGD-6183抗体-药物偶联物对一组表达GPC3的肺癌细胞系的效果，这些细胞系包括NCI-H661和NCI-H446。图9显示HCC异植体模型JHH7的结果。图10显示HCC异植体模型Huh7的结果。图11显示HCC异植体模型Hep3B的结果。图12显示肺癌异植体模型NCI-H661的结果。图13显示当与S239C或天然半胱氨酸偶联时，微管蛋白裂解素M乙酸盐稳定性和接头马来酰亚胺的稳定性的体内评估结果。定义本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，即除了少数中存在的可能天然发生的突变外，群体包含的单独抗体是相同的。修饰语“单克隆”指示该抗体获自基本均质的抗体群这一特点，而不应被解释为需要通过任何特定的方法来产生抗体。例如，根据本专利技术所用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等，Nature256:495(1975)所述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4816567)制备。也可通过例如Clackson等，Nature352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术，也可通过其他方法从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。本文所述的抗体是单克隆抗体。抗体通常以分离的形式提供。这意味着抗体通常在从其生产和纯化来源产生的干扰蛋白和其他污染物中具有至少50％w/w的纯度，但不排除可能抗体结合有过量的药学上可接受的运载体或其他载剂，便于其使用。有时抗体在生产或纯化来源的干扰蛋白和污染物中具有至少60％,70％,80％,90％,95或99％w/w的纯度。抗体(包括分离的抗体)可与细胞毒剂偶联，并作为抗体-药物偶联物提供。“分离的”多核苷酸指已从其天然组分中鉴定分离和/或回收的多核苷酸。单克隆抗体与其靶抗原的特异性结合意味着至少106,107,108,109,或1010M-1的亲和力。特异性结合在数量级上可检测地更高，且可与至少一种无关靶标的非特异性结合区别开来。特异性结合可能是由于特定官能团之间成键或特定的空间匹配(例如锁匙类型)，而非特异性结合通常是由于范德华力。针对GPC3的抗体药物偶联物和抗-GPC3抗体与GPC3特异性结合。基础抗体结构单元是亚基的四聚体。各四聚体包括两个相同的多肽链对，各对有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包含约100-110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。可变区最初表达成与可切割信号肽连接。不含信号肽的可变区有时被称作成熟可变区。因此，例如轻链成熟可变区指不含轻链信号肽的轻链可变区。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，这进而确定了抗体的同种型，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链中，下标(subscript)和恒定区之间由约12个或更多氨基酸大小的“J”链连接，而重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。(参见例如《基础免疫学》(FundamentalImmunology)第7章(Paul,W.,编，第2版，瑞文出版社(RavenPress)，纽约(1989)，在此完整引入参考)。每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。链全部显示由三个高变区(也称作互补决定区或CDR)连接的相对保守框架区(FR)的相同一般结构。每对两根链的CDR通过框架区对齐，能够与特定表位结合。从N端到C端，轻链和重链都包含结构域FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4。各结构域氨基酸的分配与Kabat，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(《免疫学热门蛋白的序列》)(马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等，Nature342:878-883(1989)的定义一致。Kabat还提供了广泛使用的编号法(Kabat编号系统)，其中不同重链可变区或不同轻链可变区之间的对应残基编以相同数字。重链恒定区的编号是根据Kabat《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Kabat，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院，1987和1991)中的EU编号系统编号的。术语“抗体”包括完整抗体及其抗原结合片段。“完整抗体”是指包含抗原结合可变区以及适合抗体类型的轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1,CH2,CH3和CH4的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。抗体片段与衍生出这些片段的完整抗体竞争与靶标的特异性结合，包括分离的重链，轻链Fab,Fab',F(ab')2,F(ab)c,双抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与人磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)蛋白特异性结合的抗体，其中抗体包括SEQ IDNO:1的三个重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:2的三个轻链CDR，其中所述CDR如Kabat定义。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180215 US 62/631,3531.一种与人磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)蛋白特异性结合的抗体，其中抗体包括SEQIDNO:1的三个重链互补决定区(CDR)和SEQIDNO:2的三个轻链CDR，其中所述CDR如Kabat定义。


2.如权利要求1所述的抗体，其是人源化、嵌合或单板(veneered)抗体。


3.如先前权利要求任一所述的抗体，包含与SEQIDNO:1具有至少80％序列相同性的成熟重链区，和与SEQIDNO:2具有至少80％序列相同性的成熟轻链可变区。


4.如先前权利要求任一所述的抗体，其是人源化抗体，包含与SEQIDNO:1具有至少90％序列相同性的成熟重链可变区，和与SEQIDNO:2具有至少90％序列相同性的成熟轻链可变区。


5.如先前权利要求任一所述的抗体，其中成熟重链可变区与SEQIDNO:1具有至少95％序列相同性，成熟轻链可变区与SEQIDNO:2具有至少95％的序列相同性。


6.如先前权利要求任一所述的抗体，其中H24被V或A占据,H38被Q、R或K占据,H48被M或I占据,H66被R或K占据,H67被V或A占据,H69被L占据,H71被A占据,H73被K或T占据,H93被G或A占据,H94被R占据,和存在以下轻链氨基酸残基：L45被R或K占据,L46被L或R占据,L105被E或V占据,L106被I或M占据；编号根据Kabat编号系统。


7.如前权利要求任一所述的抗体，其中下列可变区框架位置如指定占据：H24被V占据,H38被Q占据,H48被M占据,H66被R占据,H67被V占据,H69被L占据,H71被A占据,H73被K占据,H93被G占据,H94被R占据；编号根据Kabat编号系统。


8.如前权利要求任一所述的抗体，其中下列可变区框架位置如指定占据：L45被R占据,L46被L占据,L105被E占据,L106被I占据；编号根据Kabat编号系统。


9.如权利要求1所述的抗体，其为HALA,HALB,HALC,HBLA,HBLB,HBLC,HBLD,HBLE,HBLB-Q,HBLB-V,HCLA,HCLB,HCLC,HDLA,HDLB和HDLC。


10.如前权利要求任一所述的抗体，其中成熟重链可变区与重链恒定区融合，成熟轻链可变区与轻链恒定区融合。


11.如权利要求10所述的抗体，其中重链恒定区是天然人恒定区的突变形式，其与Fcγ受体的结合相对于天然人恒定区结合减弱。


12.如权利要求10所述的抗体，其中重链恒定区是IgG1同种型。


13.如权利要求10所述的抗体，其中重链恒定区具有包含SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的氨基酸序列，轻链恒定区具有包含SEQIDNO:7的氨基酸序列。


14.如在先权利要求任一所述的抗体，其中抗体与细胞毒性或细胞抑制剂偶联。


15.如权利要求14所述的抗体，其中偶联的细胞毒性剂是微管蛋白裂解素。


16.如权利要求14所述的抗体，其中偶联的细胞毒性剂是偶联的微管蛋白裂解素，具有以下结构：



其中偶联的微管蛋白裂解素是盐形式，特别是药学上可接受的盐形式，或其溶剂化物，其中波浪线表示微管蛋白裂解素与抗体偶联的位点；
R2A是–C(＝O)R2B,其中R2B是甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-丙-1-基、2,2-二甲基-丙-1-基,或乙烯基，或R2A是甲基、乙基、丙基、异丙基、丙-2-烯-1-基或2-甲基-丙-2-烯-1-基；和
R7B是–H或–OH。


17.如权利要求14所述的抗体，其中偶联的细胞毒性剂是偶联的微管蛋白裂解素，具有以下结构：



其中偶联的微管蛋白裂解素是盐形式，特别是药学上可接受的盐形式，或其溶剂化物，其中波浪线表示微管蛋白裂解素与抗体偶联的位点。


18.如权利要求14所述的抗体，其中偶联的细胞毒性剂是偶联的微管蛋白裂解素，具有以下结构：



其中偶联的微管蛋白裂解素是盐形式，特别是药学上可接受的盐形式，或其溶剂化物，其中波浪线表示微管蛋白裂解素与抗体偶联的位点。


19.一种抗GPC3抗体药物偶联物化合物，其具有下式：



的盐形式，具体是药学盐形式，或其溶剂化物，或具有上式，其中硫-取代的琥珀酰亚胺是水解形式；其中
A是拉伸单元；
R2A是–C(＝O)R2B,其中R2B是甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-丙-1-基、2,2-二甲基-丙-1-基,或乙烯基，或R2A是甲基、乙基、丙基、异丙基、丙-2-烯-1-基或2-甲基-丙-2-烯-1-基；
R7B是–H或–OH；
Ab是权利要求1-16任一所列抗体；
S是来自抗体的硫原子；和
下标p是1至4的整数。


20.如权利要求19所述的抗GPC3抗体药物偶联物化合物，其中化合物具有下式：






的盐形式，具体是药学盐形式，或其溶剂化物，或具有上式之一，其中硫-取代的琥珀酰亚胺是水解形式。


21.如权利要求19所述的抗GPC3抗体药物偶联物化合物，其中化合物具有下式：



的盐形式，具体是药学盐形式，或其溶剂化物，或具有上式之一，其中硫-取代的琥珀酰亚胺是水解形式。


22.如权利要求19所述的抗GPC3抗体药物偶联物化合物，其中化合物具有下式：



的盐形式，具体是药学盐形式，或其溶剂化物，或具有上式之一，其中硫-取代的琥珀酰亚胺是水解形式。


23.如权利要求19-22任一所述的抗体药物偶联物化合物，其中与Ab的结合是通过Ab工程化半胱氨酸残基的硫原子。


24.如权利要求19-22任一所述的抗体药物偶联物化合物，其中与Ab的结合是通过硫原子或重链恒定区239位的工程化半胱氨酸残基，根据EU编号系统。


25.如权利要求19-22任一所述的抗体药物偶联物化合物，其中p是2。


26.一种抗体药物偶联物组合物，包含一群抗GPC3抗体药物偶联物化合物，具有下式：



的盐形式，具体是药学盐形式，或其溶剂化物，或具有上式，其中硫-取代的琥珀酰亚胺是水解形式；其中
A是拉伸单元；
R2A是–C(＝O)R2B,其中R2B是甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-丙-1-基、2,2-二甲基-丙-1-基,或乙烯基，或R2A是甲基、乙基、丙基、异丙基、丙-2-烯-1-基或2-甲基-丙-2-烯-1-基；
R7B是–H或–OH；
Ab是权利要求1中所示抗体；
S是来自抗体的硫原子；和
对于每个抗体药物偶联物化合物，下标p是1到4的整数；和组合物的平均药物荷载为约2，
以及
下标p是1到4的整数；和组合物的平均药物荷载为约2。


27.如权利要求26所述的抗体药物偶联物组合物，其中抗体药物偶联物化合物具有下式：



的盐形式，具体是药学盐形式，或其溶剂化物，或具有上式之一，其中硫-取代的琥珀酰亚胺是水解形式。


28....

【专利技术属性】
技术研发人员：T·比彻勒，W·阿瑟，P·伯克，L·韦斯滕多夫，
申请(专利权)人：西雅图基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US