本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种独特的基因构建物，所述构建物兼容了ＴＰＡ反应元件、巨细胞病毒启动子、报告基因和抗性基因的元件，这些元件可良好的配合，在转染入哺乳动物细胞后，可在细胞内高灵敏度地报告蛋白激酶Ｃ信号通路的情况。本发明专利技术还公开了含有所述构建物的载体，含有所述载体的细胞，所述细胞可作为模型用于蛋白激酶Ｃ信号通路调节药物的筛选。本发明专利技术提供的报告基因细胞模型可用于筛选与蛋白激酶Ｃ信号通路相关的药物，具有机制明确、操作简便、可高通量化的特点，对蛋白激酶Ｃ信号通路相关的药物筛选有积极的意义。
Reporter gene cell model for screening drugs and method for constructing the same
The invention belongs to the field of biotechnology, discloses a unique gene constructs, the construct is compatible with the TPA response element, cytomegalovirus promoter, reporter gene and resistance gene with the elements, these elements may be good, in transfected into mammalian cells with high sensitivity, can report the protein kinase C pathway in the cells of the situation. The present invention also discloses vectors containing the constructs, cells containing the vectors, which can be used as models for modulating protein kinase C signaling pathways and modulating drug screening. Reporter gene cell model provided by the invention can be used for drug screening and protein kinase C signaling pathway, with clear mechanism, easy operation and characteristics of high-throughput, on protein kinase C signaling pathway related drug screening has positive significance.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，更具体的，本专利技术涉及一种独特的基因构建物， 含有所述构建物的载体，含有所述载体的细胞，所述细胞可作为模型用于蛋白激酶c信号通路调节药物的筛选。
技术介绍
随着现代生物技术的快速发展，基于细胞的药物筛选模型被广泛应用于新 药开发，特别是在对大量化合物的高通量筛选中。蛋白激酶C(PKC)是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号传递过 程中起重要作用，介导多种膜受体，如G蛋白偶联受体，酪氨酸激酶受体等的 跨膜信号转导。受体激活后导致下游信号分子的活化，如G蛋白、PLC等，这些 信号分子再进一步活化PKC，进而引起基因的转录。TPA反应元件(TRE)是与PKC 信号偶联的反应元件，当PKC激活后会导致转录因子AP-1与TRE的结合，从而激 活TRE下游的基因转录。PKC与多种疾病相关，如肿瘤侵袭、糖尿病综合症、脉管类疾病等，目前 正作为一个热门的药物靶点进行新药开发。已上市的PKC抑制剂有礼来公司的 ruboxistaurin ，用于治疗糖尿病视网膜综合症，另外还有多个PKC 抑制剂正在进行临床研究，包括治疗糖尿病微血管并发症的PKC-P抑制剂，治 疗乳腺癌的PKC- a反义药物Af f initak ，治疗多形性成胶质细胞瘤的4enzastaurin等。PKC信号通路还与多种细胞膜受体的功能相关，可以通过检测PKC的激活间 接监测受体的活性，从而用于受体的药物筛选。G蛋白偶联受体是人体内最主 要的一类与疾病相关的细胞膜受体超家族，其内源配体囊括了激素，神经递质， 细胞因子，钙离子，以及感官刺激等。市场上有近2/3 的药物都通过作用于GPCR起效，在药物开发中具有巨大价值。综上，本领域还有必要进一步开发调节PKC信号通路的物质，建立筛选PKC 信号通路调节物质的模型或方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可用于筛选调节蛋白激酶C(PKC)信号通路的 物质的细胞模型及其用途。本专利技术的目的还在于提供基于所述细胞模型来筛选调节PKC信号通路的物 质的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种构建物，所述构建物从5'端到3'端依次 含有式I所示的结构A—B—C (式I) 其中，A具有SEQ ID NO: 5中第2-82位所示的序列(较佳的，A由SEQ ID NO: 5中第2-82位所示的序列构成)；B为巨细胞病毒(CMV)启动子序列； C为报告基因序列。在另一优选例中，所述的构建物从5'端到3'端依次含有式II所示的结构A—B—C—D (式II) 其中，D为Zeocin抗性基因序列;在另一优选例中，所述的报告基因选自绿色荧光蛋白(GFP)基因，禾口/或荧光素酶(lucif erase)基因。在另一优选例中，所述的绿色荧光蛋白是增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。 在另一优选例中，所述的报告基因是绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因的融合基因。在另一优选例中，绿色荧光蛋白基因位于荧光素酶基因的下游。 在另一优选例中，A、 B、 C或D各元件之间为可操作地相连接。 在另一优选例中，A、 B、 C或D各元件之间具有0-1000bp的间隔序列。优选 的，A、 B元件之间具有0-20bp(更佳的0-10bp，如3bp)的间隔序列；B、 C元件 之间具有0-1000bp(如735bp)的间隔序列；C、 D元件之间具有0-600bp(如371bp) 的间隔序列。在本专利技术的第二方面，提供一种载体，所述的载体中含有所述的构建物。 在本专利技术的第三方面，提供一种细胞，所述细胞具有蛋白激酶C信号通路；并且，所述细胞含有所述的载体；或 其基因组中整合有所述的构建物。 在另一优选例中，所述的细胞是真核细胞。在另一优选例中，所述的细胞选自(但不限于)CH0细胞，HEK-293细胞或 Hela细胞。在另一优选例中，所述的细胞含有Gi/o偶联的G蛋白偶联受体(GPCR，如CCR5) 或酪氨酸激酶受体(也是PKC通路成员)。在本专利技术的第四方面，提供所述的细胞的用途，用于筛选调节(如激活或 抑制)蛋白激酶C(PKC)信号通路的物质(如小分子、化合物或多肽)。在另一优选例中，所述的细胞用于蛋白激酶C激活剂(如激动剂)或抑制剂 (如拮抗剂)的筛选，或用于G蛋白偶联受体的激活剂或抑制剂的筛选。在本专利技术的第四方面，提供一种筛选调节蛋白激酶C信号通路的潜在物质的方法，所述方法包括(1) 将候选物质给予所述的细胞；和(2) 检测所述细胞中报告基因的表达情况；其中，若所述候选物质可提高报告基因的表达，则表明该候选物质是激活 蛋白激酶C信号通路的潜在物质；若所述候选物质可降低报告基因的表达，则 表明该候选物质是抑制蛋白激酶C信号通路的潜在物质。在另一优选例中，步骤(l)包括在测试组中，将候选物质加入到所述的 细胞(或细胞培养物)中；和/或步骤(2)包括检测测试组的体系中报告基因的表达，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不添加所述候选物质的所述的细胞；如果测试组中报告基因的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高50°/。以 上，较佳的高100%以上；更佳的高200。/。以上)对照组，就表明该候选物是激活 蛋白激酶C信号通路的潜在物质；如果测试组报告基因的表达在统计学上低于 (优选显著低于，如低50%以上，较佳的低100%以上；更佳的低200%以上)对照 组，就表明该候选物是抑制激活蛋白激酶C信号通路的潜在物质。在另一优选例中，所述方法还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步的 细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于调节蛋白激酶C信号通路有 用的物质。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。附图说明图l显示了重组报告基因载体的示意图。图2显示了PKC激动剂在转染了报告基因载体的HEK-293细胞中可激活荧光素酶的表达。其中，A，转染了报告基因质粒但未加入PKC激动剂刺激的细胞；B，转染了报告基因质粒同时还加入100nM PKC激动剂刺激的细胞；C，裂解细胞后检测得到的荧光素酶活性与gal(beta-gal)活性的比值比较(n二2，平均值士标准偏差)。图3显示了PKC激动剂在转染了报告基因载体的Hela细胞中可激活荧光素酶的表达。其中，A，转染了报告基因质粒但未加入PKC激动剂刺激的细胞；B，转染了报告基因质粒同时还加入100nM PKC激动剂刺激的细胞，C，裂解细胞后检测得到的荧光素酶活性与P-gal活性的比值比较(n二2，平均值士标准偏差)。图4显示了PKC激动剂以及CCR5激动剂在CH0/CCR5/luc细胞系中均可激活报告基因的表达。其中，A，未加入激动剂剌激的CH0/CCR5/luc细胞；B，加入100nM PKC激动剂PMA刺激的CH0/CCR5/luc细胞；C，加入10nM CCR5激动剂RANTES刺激的CH0/CCR5/luc细胞；D，裂解细胞后检测得到的荧光素酶活性比较(『2，平均值士标准偏差)。图5显示了CCR5激动剂RANTES对CH0/CCR5/luc细胞系中报告基因的激活作 用呈浓度依赖性。其中，A， CH0/CCR5/luc G4克隆； B， CH0/CCR5/luc E8克隆； C， CH0/CCR5/luc A10克隆; D， CH0/CCR5/luc Hll克隆； E本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种构建物，其特征在于，所述构建物从５’端到３’端依次含有式Ｉ所示的结构： Ａ－Ｂ－Ｃ （式Ⅰ） 其中，Ａ具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５中第２－８２位所示的序列； Ｂ为巨细胞病毒启动子序列； Ｃ为报告基因序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：裴钢，吴瑜，陈力，陈仁海，翟培彬，张瑾，应锁环，苏杨，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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