本发明专利技术公开了一种HCV蛋白酶抑制剂筛选模型。本发明专利技术提供了融合蛋白(a)或(b)：(a)自N端至C端依次含E173N片段、特异多肽片段和E173C片段；(b)自N端至C端依次含E173N片段、特异多肽片段、E173C片段、2A片段和NS3/4A片段；E173N片段如序列4第1至173位所示；E173C片段如序列4自第187至252位所示；特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被蛋白酶识别；2A片段如序列6第253至279位所示；NS3/4A片段如序列6第280至479位所示。利用上述融合蛋白可从蛋白、多肽文库以及天然产物中筛选NS3-4A蛋白酶抑制剂，为HCV感染治疗提供候选药物分子，并为高通量筛选多种蛋白酶抑制剂奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种HCV蛋白酶抑制剂筛选模型，特别涉及一种HCV蛋白酶抑制剂筛选模型的构建与应用。
技术介绍
丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus,HCV)感染严重危害人类生命健康。据世界卫生组织统计，全世界有超过I. 7亿人受到HCV的慢性感染(Sy T，Jamal丽.Epidemiologyof hepatitis C virus (HCV) infection. Int J Med Sci. 2006,3(2) :41-6)。我国有约 4000万HCV感染患者，HCV感染已成为严重的世界公共卫生问题之一。HCV感染可转变为慢性肝炎，甚至发展为肝硬化和肝癌。当前采用的最有效的治疗方案是α-干扰素和利巴韦林联合治疗，但这种治疗方法疗效低于50%，且费用高，副作用大，因此，研制新的抗HCV药物是当前重要而且紧迫的任务。HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股、正链RNA。HCV基因组全长约9. 6kb，由两侧非编码区(UTR)及位于其间的单一开放阅读框组成。5' -UTR含有内部核糖体进入位点(IRES)，非常保守，核糖体与其结合启动翻译过程；3' -UTR对与复制起始有关。开放读码框编码大约3010 3033个氨基酸的多聚蛋白前体。该蛋白前体在宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的共同作用下生成4个结构蛋白和至少6个非结构(non-structure，NS)蛋白。按顺序依次为 core-El-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。其中，C2, El,E2，P7为结构蛋白区，在宿主细胞信号肽的作用下分别裂解成核蛋白和包膜蛋白；NS2-NS5为非结构蛋白区。HCV多聚蛋白前体的加工过程是结构蛋白core，El, E2和P7被宿主信号肽酶切开，均固定在膜上。NS2的N端也被宿主信号肽酶切开，NS2 94-217位氨基酸与NS3 1-180位氨基酸构成NS2/3丝氨酸蛋白酶，在NS2-NS3连接处产生切割(顺式切割)，释放出NS3(NS3 181-631位氨基酸是RNA解旋酶)，NS3丝氨酸蛋白酶对其下游的四个连接位点进行切割，释放出NS4A，NS4B(内质网锚定蛋白)，NS5A(RNA结合蛋白)，NS5B(RNA依赖的 RNA 聚合酶)(Lorenz IC, Marcotrigiano J, Dentzer TG, et al. Structure ofthe catalytic domain of the hepatitis C virus NS2-3protease[J]. Nature,2006,442(7104) :831-835.)。HCV NS3蛋白是一个具有多功能生物活性的非结构蛋白，在HCV复制和致病机制中起着非常关键的作用(O tsuka M, Kato N, L an K, et al. Hepatitis C Virus CoreProtein Enhances p53 Function through Augmentation of DNA Binding Affinityand Transcriptional Ability[J], J Biol Chem. 2000Nov 3 ；275(44) :34122-30.)。NS3基因位于丙型肝炎病毒全基因组序列约3300 5200nt区域，编码含有630个氨基酸(1027-1656aa)的NS3蛋白。其N末端1/3具有丝氨酸蛋白酶活性，C末端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPase)和RNA解旋酶活性。其中，NS3丝氨酸蛋白酶是HCV整个非结构蛋白加工和成熟过程中的关键酶，它必须在NS4A的辅助作用下，二者形成异源二聚体，才能发挥酶活性，因此又常被称为 NS3/4A 蛋白酶(Satoh S, Tanji Y,Hi jikataM, et al. The N-terminalregion of hepatitis C virus nonstructural protein 3(NS3)is essential for stablecomplex formation with NS4A[J]. J Virol, 1995,69 (7) :4255-4260.)。晶体衍射结构表明，NS4A中间的中央疏水区(21 34aa)与NS3的N末端22个氨基酸形成β片层，是酶发挥活性的必需结构要求(Kim J L, Morgenstern K A, Lin C, et al. Crystal structureof the hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4Acofactor peptide [J]. Cell, 1996,87 (2) :343-355.)。而NS4A (21 34aa)可以被合成的多肽所代替，或通过连接子与NS3的N末端ISOaa直接相连为单链蛋白，不影响酶活性功能的发挥。NS3丝氨酸蛋白酶在4个连接区域切割多聚蛋白前体，以顺式方式催化NS3/NS4A裂解(自我剪切)，反式方式催化NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B裂解，释放出多个重要的病毒活性酶(Bartenschlager R, Ahlborn-Laake L,Mous J, Jacobsen H. Nonstructuralprotein 3 of the hepatitis C virus encodes a serine-type proteinase requiredfor cleavage at the NS3/4and NS4/5junctions[J]. J Virol. 1993 Jul ；67 (7)3835-44. ；Eckart, M. R. , Selby, M. ,Masiarz, F. ,et al. The hepatitis C virus encodes a serine protease involved in processing of the putative nonstructural proteinsfrom the viral polyprotein precursor[J]. Biochem Biophys Res Commun. 1993 Apr30 ；192 (2) :399-406.)。对各位点的切割效率大小比较为NS5A/NS5B > NS4A/NS4B > > NS4B/NS5A(Landro JA, Raybuck SA, Luong YP, et al. Mechanistic role of an NS4A peptidecofactor with the truncated NS3 protease of hepatitis C virus !elucidationof the NS4A stimulatory effect via kinetic analysis and inhibitor mapping.Biochemistry[J]. 1997Aug 5 ；36 (31) :9340-9348. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种蛋白质，为如下(a)或(b) (a)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白质E173N片段、特异多肽片段和E173C片段； (b)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白质E173N片段、特异多肽片段、E173C片段、2A片段和蛋白酶； 所述(a)中所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第I至173位氨基酸残基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被蛋白酶识别； 所述(b)中所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第I至173位氨基酸残基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位 氨基酸残基所示；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被所述蛋白酶识别。2.如权利要求I所述的蛋白质，其特征在干 所述(a)中，所述特异多肽片段为识别短肽NS5A/5B;所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸残基所示； 所述(b)中，所述特异多肽片段为识别短肽NS5A/5B;所述识别短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸残基所示；所述蛋白酶的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第280至479位氣基酸残基所不。3.如权利要求2所述的蛋白质,其特征在于所述蛋白质的氣基酸序列如序列表的序列4或序列表的序列6所示。4.编码权利要求I所述蛋白的基因，为DNA分子甲或DNA分子こ； 所述DNA分子甲自5’末端至3’末端依次含有如下元件E173N片段的编码基因、特异多肽片段的编码基因和E173C片段的编码基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第I至173位氨基酸残基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被蛋白酶识别； 所述DNA分子こ自5’末端至3’末端依次含有如下元件E173N片段的编码基因、特异多肽片段的编码基因、E173C片段的编码基因、2A片段的编码基因和蛋白酶的编码基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第I至173位氨基酸残基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸残基所示；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸残基所示；所述特异多肽片段由30个以下的氨基酸残基组成且可被所述蛋白酶识别。5.如...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵志虎，师明磊，陈娜，闫兴，王洋，张彦，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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